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1、第六章 真核生物的基因表达调控,学习目的和要求1、了解基因家族的概念；2、掌握真核基因表达与调控的一般规律与特点；3、掌握真核生物基因表达调控在不同表达阶段的具体作用特征；4、重要顺式作用元件与反式作用因子的基本概念、作用特征及蛋白质结构与功能特点；5、掌握转录因子活性调节的主要方式。,（教材P.280-337）,第一节概述,基因表达调控最明显的特征是能在特定时间和特定的细胞中激活特定的基因，从而实现“预定”的、有序的、不可逆的分化和发育过程，并使生物的组织和器官在一定的环境条件范围内保持正常的生理功能。,（教材P.280-282）,真核生物基因表达调控,瞬时调控或可逆调控,相当于原核生物对环
2、境条件变化所做出的反应。瞬时调控包括某种代谢底物浓度或激素水平升降时，或细胞周期在不同阶段中酶活性和浓度的调节。,发育调节或不可逆调控,真核生物基因表达调控的精髓，它决定了真核生物细胞分化、生长和发育的全过程。,据基因调控在同一事件中发生的先后次序，又可将其分为：转录水平调控（transcriptional regulation）转录后水平的调控（post transcriptional regulation）翻译水平调控（translational regulation）蛋白质加工水平的调控（regulation of protein maturation）,研究基因调控应回答下面三个主要问
3、题：什么是诱发基因转录的信号？基因调控主要是在那个环节（模板DNA转录，mRNA的成熟或蛋白质合成）实现的？不同水平基因调控的分子机制是什么？,一、真核基因组的复杂性,1.基因组大；2.染色质在核膜内；3.基因组是二倍体或多倍体；4.没有操纵子结构；5.基因组中仅约10%的序列为蛋白质、rRNA、tRNA等编码，其余约90%的序列功能至今还不清楚。6.有外显子（exon）和内含子（intron）；7.存在大量重复序列；8.基因转录的调节区相对较大；9.真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质。,二、真核基因表达调控的特点,（一）真核基因表达调控的环节
4、更多；,（二）真核基因的转录与染色质的结构变化相关；,（三）真核基因表达以正性调控为主。,三、基因家族,真核细胞中许多相关的基因常按功能成套组合，被称为基因家族（gene family）。,1、简单多基因家族-基因一般以串联方式前后相连,（教材P.282-286）,2、复杂多基因家族 一般由几个相关基因家族构成，基因家族之间由间隔序列隔开，并作为独立的转录单位。,3、发育调控的复杂多基因家族,第二节真核生物DNA水平上的基因表达调控,一、染色质结构对真核基因转录的调控,1.染色质结构影响基因转录,常染色质中的基因可以转录 异染色质(heterochromatin)无基因转录表达。,2.组蛋白的
5、作用,组蛋白扮演了非特异性阻遏蛋白的作用 非组蛋白成分起到特异性的去阻遏促转录作用 核小体结构影响基因转录。,（教材P.288-296）,二、基因扩增对基因表达的影响,基因扩增（gene amplification）是指在没有发生细胞分裂，整条染色体几乎没有复制的情况下，细胞内某些特定基因的拷贝数专一性增加的现象。它使细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要，是基因活性调控的一种方式。,1、为满足正常的生长发育需要 如两栖类和昆虫卵母细胞rRNA基因的扩增:卵母细胞中的rDNA拷贝数比体细胞中增加了4000倍。在果蝇滤泡细胞中，编码卵壳蛋白的卵壳基因的扩增。2、外界环境因素引起基因扩
6、增 基因扩增与肿瘤形成及细胞衰老有关。在原发性的视网膜细胞瘤中，含myc 原癌基因的DNA区段扩增10-200倍。许多致癌剂可诱导DNA扩增。,三、基因重排对基因表达的影响,将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录，这种方式被称为基因重排。,（教材P.290-292）,四、DNA甲基化与基因活性的调控,真核DNA中的胞嘧啶约有5%被甲基化为5-甲基胞嘧啶(5-methylcytidine,m5C)，而活跃转录的DNA段落中胞嘧啶甲基化程度常较低。甲基化可使基因失活，去甲基化又可使基因恢复活性。,Hpa,Hpa只能切非甲基化的CCGG，所以只有一个切点，产生两条带；Msp可以切
7、甲基化和未甲基化的CCGG，因此有两个切点，产生3条电泳带。,（教材P.292-296）,五、基因丢失,在细胞分化过程中，通过丢掉某些基因而去除其活性。例如某些原生动物，线虫、昆虫、甲壳类动物，体细胞常丢掉部分或整条染色体，只保留将来分化产生生殖细胞的那套染色体。例如在蛔虫胚胎发育过程中，有27DNA丢失。在高等动植物中，尚未发现类似现象。许多生物各类不同的细胞或细胞核都具有全能性totipotency。,第三节真核基因转录水平的调控,一、顺式作用元件（cis acting elements）,（一）启动子(1)核心启动子成分，如TATA框；(2)上游启动子成分（UPE），如CAAT框，GC框
8、，八聚体（octamet）ATF结合位点；(3)远上游顺序（UAS）：如增强子，酵母中的UAS（upstream activator seguences）减弱子、静息子等。(4)特殊细胞中的启动子成分：如淋巴细胞中的Oct（octamer）和B。,（教材P.296-328）,B.Lewin:GENES.1994,table 29.3,（二）增强子（Enhancer）,1981年Benerji,Rusconi和Chambom等发现，又称远上游序列（far upstream seguence）。最早SV40病毒中发现长约200bp的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍。100-200bp长度
9、，由若干组件构成，其基本核心组件常为8-12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。,增强子：在真核细胞中通过启动子来增强转录的一种远端遗传性控制元件。,（教材P.298-299）,增强子的特性：,功能与位置和方向无关，能远距离发挥作用,增强效应十分明显；,组织或细胞特异性,大多为重复序列；,不具有启动子专一性,受外部信号的调控,（三）沉默子（silencer）,负性调控元件，它与转录抑制因子结合抑制转录。最早在酵母中发现，以后在T淋巴细胞的T抗原受体基因的转录和重排中证实其存在。沉默子的作用特点：不受序列方向的影响，能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。,（四）上游激活序列（upstr
10、eam activating seguences，UASs）,类似于增强子。作用：影响转录程度，对位点选择不起作用。有方向性，不能在启动子的下游起作用。结合的转录因子是GCN4和GAL4，识别位点为ATGACTCAT。,（五）效应元件（response element）,一组受到共同调控的基因，都有一个相同的元件（序列），此元件能与某一个(类)专一蛋白结合，使基因对其作出反应。特点：有短的保守顺序；是启动子或增强子的上游元件。在不同基因中，拷贝相似，有时有多个拷贝；与转录起点距离不固定。,（六）绝缘子（insulator）,能阻断激活或失活效应通过的元件。特性：在增强子和启动子之间，阻断增强子
11、对启动子的激活作用在活性基因和异染色质之间，能保护基因被异染色质延伸带来的失活效应,二、反式作用因子（trans acting factors）,反式作用因子：能调节与它们接触的基因的表达的各种扩散分子（通常是蛋白质），如转录因子；其编码基因与其识别或结合的靶核苷酸序列不在同一个DNA分子上。转录因子(transcription factor)是起正调控作用的反式作用因子。转录因子是转录起始过程中RNA聚合酶所需的辅助因子。真核生物基因在无转录因子时处于不表达状态，RNA聚合酶自身无法启动基因转录。,（一）反式作用因子分类和作用方式,1、分类 通用反式作用因子，在一般细胞中普遍存在，主要识别一
12、些启动子的核心启动成分TATA框，如TBP；上游启动子成分CAAT框，如CTF/NF-1；GC框如SP1；识别八聚体核苷酸Oct-1等；特异反式作用因子：特殊组织与细胞中的，如淋巴细胞中的Oct-2；诱导型因子：和反应性元件（response elements）相结合的反式作用因子。,2、调控方式 蛋白质和DNA相互作用 蛋白质和配体结合 蛋白质之间的相互作用 蛋白质的修饰。,（二）转录因子的结构特征,DNA binding domain，BD：100aa，氢键，大沟 transcription active domain，AD：30-100aa regular domain：与其它因子或调控
13、蛋白结合 不与DNA直接结合的转录因子没有DNA结合域，通过转录激活域直接或间接作用与转录复合体而影响转录效率。,（三）反式作用因子中的DNA识别或结合域,与DNA结合的功能域常见以下几种结构花式/基元：锌指（Zinc finger region）螺旋-转角-螺旋结构（helix-turn-helix，HTH）；螺旋-环-螺旋结构（helix-loop-helix，HLH）：亮氨酸“拉链”式二聚体（leucine zipper）；,motif（基序，基元，花式）：构成任何一种特征序列或结构的基本单位，是超二级结构。,1、螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix,HTH）,至少有两个螺
14、旋，其间由短肽段形成的转角连接；二聚体形式存在；距离正好相当于DNA一个螺距（3.4nm），两个螺旋刚好分别嵌入DNA的深沟。,（教材P.300-301）,LacO的R蛋白阻遏蛋白与cro蛋白CAP酵母接合型调控蛋白1，2玉米的Kn1水稻的OSH1,许多调控蛋白都有HTH,2、锌指（zinc finger）,Zn2+与4个Cys、或2个Cys和2个His相结合。整个蛋白质分子有2-9个锌指重复单位。每一个单位的指部伸入DNA双螺旋的深沟，接触5个核苷酸。,（教材P.301-303）,（1）I型锌指：2Cys/2His,23aa Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His
15、-X3-His Cys，His与Zn2+结合形成4面体结构，使中部的氨基酸回折成环，凸出如手指 中部芳香族氨基酸保守，疏水 串联重复排列，两指间7-8aa 锌指数目多少不等,与GC盒结合的转录因子SP1中有连续的3个锌指重复结构。,SP1,TF III A,344aa，N端与DNA结合9个锌指，每个30aa与5s rRNA基因内启动子（50bp)结合,（2）型锌指：4Cys,保守序列为：Cys-X2-Cys-X13-Cys-X2-Cys Zn2+与4个Cys结合 DNA结合序列较短，对称 无大量重复性锌指 Cys2/Cys2与 Cys2/His2不同 例如GAL4，酵母的转录因子，哺乳类的固醇
16、类激素受体,糖皮质激素特异性,雌激素特异性,类固醇激素受体是以二聚体形式发挥其促进转录作用的。它们的两个锌指的功能不同。第1个锌指的右侧是控制与DNA结合的，第2个锌指的左侧则是控制形成二聚体的能力的。,3、同源域（Homeodomain）,最早在果蝇的homeotic loci（决定身体结构）中发现同形异位现象(homeosis):果蝇头部长触角部位长出脚来。同形异位盒基因(homeobox):高度保守的一段核苷酸序列（180bp）,控制胚胎发育的基因。从酵母到人类都存在；homeobox,DNA序列高度保守。,（教材P.304-305）,Homeodomain,有3个helix,H1与H2
17、平行H2与H3形成HTH motifH3位于大沟中，与DNA特异结合N末端位于小沟中，与DNA接触,HD与HTH的不同：（1）HD的C端由3个-螺旋构成，螺旋3结合于大沟；而HTH至少2个-螺旋构成；（2）HTH以二聚体形式与DNA结合，而HD是以单体形式与DNA结合。,-COOH，每隔6个氨基酸出现一个Leu，所有Leu出现在同一侧面，成直线排列，形成疏水面,依靠Leu的疏水作用，2个helix 相互缠绕，形成拉链结构,-NH2,富含碱性氨基酸，螺旋状，碱性DNA结合域，与DNA双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合,4、碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper,bZIP）,（教材
18、P.303-304）,5、碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix）,4050aa 含2个-helix（1516aa）,由连接区（1228aa）连接；两亲性,amphipathic；通过疏水面作用形成二聚体；NH2端为碱性结合区，16aa，其中6aa为保守序列。,（教材P.304）,缺乏碱性区的蛋白质，即使形成（同、异）二聚体，也无法同DNA结合,（四）蛋白质和配体的结合,甾类受体蛋白有3个不同的功能区：（1）N-端区是激活转录所需的区域，不同受体之间此区的同一性仅小于15%；（2）DNA结合及转录活化区，同一性较高为94-42%；（3）C-端的激素结合和二聚体形成区，
19、同一性为57-15%。,糖皮质激素对转录的调控,激素-受体复合物进入细胞核，与增强子结合从而激活启动子，开始转录。,糖皮质激素进入细胞，与受体结合；,（五）DNA结合蛋白主要转录激活结构域,转录激活结构域（transcription activation domains）一般由20-100个氨基酸残基组成。如GAL4分子中有2个这种结构域，分别位于多肽链的第147-196位和第768-881位；GCN4的转录激活结构域位于多肽链的第106-125位。,（教材P.305-306）,1、酸性-螺旋（acidic-helix）（A区）,该结构域含有由酸性氨基酸残基组成的保守序列，多呈带负电荷的亲脂性
20、-螺旋，包含这种结构域的转录因子有GAL4、GCN4、糖皮质激素受体和AP-1/Jun等。增加激活区的负电荷数能提高激活转录的水平。可能是通过非特异性的相互作用与转录起始复合物上的TFIID等因子结合生成稳定的转录复合物而促进转录。,2、谷氨酰胺丰富区(glutamine-rich domain)（P区）SP1的N末端含有2个主要的转录激活区，氨基酸组成中有25%的谷氨酰胺，很少有带电荷的氨基酸残基。酵母的HAP1、HAP2和GAL2及哺乳动物的OCT-1、OCT-2、Jun、AP2和SRF也含有这种结构域。,3、脯氨酸丰富区(proline-rich domain)（Q区）,CTF家族（包括
21、CTF-1、CTF-2、CTF-3）的C末端与其转录激活功能有关，含有20%-30%的脯氨酸残基。,（六）蛋白质之间的相互作用,酵母半乳糖代谢中GAL80和GAL4的相互作用就是很好的例子。起负调节作用的蛋白GAL80不直接和DNA结合，而是通过和作为转录激活因子的GAL4蛋白结合，占据其功能域来阻遏转录的；作为正调节因子不仅需要半乳糖作为诱导物，还需要GAL4蛋白作为转录因子，GAL4和调节基因上游元件UAS结合，促进转录。,（七）蛋白质的修饰,蛋白质的磷酸化和去磷酸化是其转录活性调节的一种普遍形式。,（教材P.307-322）,（八）与已知DNA序列相结合的反式作用因子,a.CAAT盒激活
22、因子,CTF（CAAT box transcription factor）家族，结合CAAT box，作用于大沟，无组织专一性 CP族蛋白（CP1、CP2、CP3）能与腺病毒DNA相结合。CBP对序列GCAAT有较强的亲和力，ACF则对卵清蛋白基因启动子区的CCAAT有高亲和力。,2、TATA区结合蛋白,3、GC区结合因子,SP1 C末端 DNA结合域,3个Zn 指 2个活化结构域,rich-Gln 在大沟中结合GC box，一个SP1结合20bp,无组织特异性，作用无方向性，可提高转录10-25倍 最初SV40中发现，普遍存在于脊椎动物中，有6万/细胞,能被多个激活蛋白识别。Oct-1 非淋
23、巴细胞中结合八碱基对元件的转录激活因子，没有组织特异性。Oct-2则是组织特异的激活因子。一个特定的共有序列元件能被相应的转录因子或一个转录因子家族的成员所识别，而相同的元件也能被不同的转录因子所识别。,4、八碱基对元件激活蛋白,第四节真核基因转录后加工水平的调控,一、mRNA前体的可变剪接二、mRNA前体的反式剪接三、RNA编辑,（教材P.329-332）,第五节真核基因翻译和翻译后水平的调控,蛋白质合成翻译阶段基因调控的三个方面：蛋白质合成起始速率的调控；mRNA的识别；激素等外界因素的影响。,一、mRNA的运输控制,运输控制（transport control）是对转录本从细胞核运送到细
24、胞质中的数量进行调节。合成的RNA大约有1/12能被运出核进入细胞质，50左右的在核内降解，还有一些留在核内。,二、mRNA翻译的控制,mRNA的寿命 原核生物mRNA的半衰期很短，平均大约3min。高等真核生物迅速生长的细胞中mRNA的半衰期平均3h。在高度分化的终端细胞中许多mRNA极其稳定，有的寿命长达数天。,在细胞质中所有的RNA都要受到降解控制（degradation control）。不同mRNA降解效率的不同，加入调节物可以增加mRNA稳定性，并使相关基因转录速率增加 mRNA的选择性降解主要由于核酸酶和mRNA内部结构相互作用的结果。,（教材P.335）,三、mRNA的结构和翻
25、译的效率,5m7G帽结构是否存在和是否易于接近eIF-4F的程度对翻译效率有着明显的影响。起始密码子AUG的位置和其侧翼的序列对翻译的效率也有影响。5端非翻译区的长度也会影响到翻译的效率和起始的精确性，当此区长度在1780Nt之间时，体外翻译效率与其长度变成正比。在5UTR中存在碱基配对区时，可以形成发夹式或茎环二级结构，这类结构会阻止核糖体40S亚基的迁移，对翻译起始有抑制作用。,1、mRNA5前导序列对翻译水平的影响,2、mRNA3端的结构对翻译速率和mRNA寿命的影响,mRNA 3端的poly(A)不仅和mRNA穿越核膜的能力有关，而且影响到mRNA的稳定性和翻译效率。poly(A)越长
26、mRNA作为模板的使用的半衰期越长。poly(A)对翻译的促进作用是需要PABP（poly(A)结合蛋白）的存在。,四、翻译的起始调节,翻译起始因子eIF-2磷酸化，磷酸化后不能重复利用，从而选择性地降低或加强一些mRNA的翻译。当细胞处在异常环境（如饥饿、pH变动、重金属处理、加入化学药品等）或蛋白质生物合成受抑制时，都可以检测到细胞内eIF-2的磷酸化作用。,（教材P.329-332）,五、选择性翻译,珠蛋白是由两条链和两条链组成的。在二倍体细胞中都有4个，2个；如果它们相同转录和翻译的话它们之间的浓度比应是：=2：1，而实际上是1：1，珠蛋白和珠蛋白是在翻译水平上存在的差异，即和翻译起始
27、因子的亲和性不同。,用微量注射器将微管蛋白注入到哺乳动物细胞中，会抑制微管蛋白的进一步合成。,六、翻译的自我调节,七、转铁蛋白mRNA的翻译调控,翻译延伸过程对蛋白质合成的影响 翻译过程并非一定能从起始密码到终止密码，有些中间形成茎环二级结构，阻止延伸；另外，在翻译延伸过程中出现移框翻译，翻译时向前或向后移动一个核苷酸，从而改变翻译的产物。,八、翻译后水平的调控,1、蛋白质的折叠,2、蛋白酶的切割,（1）末端切割蜜毒素,胰岛素,（2）多聚蛋白质切割,3、蛋白质的化学修饰,（1）简单修饰：乙酰化、甲基化和磷酸化,（2）复杂修饰：糖基化(glycosylation),4、蛋白质内含子,特点：（1）
28、切割位点保守（2）具有自动切割加工能力（3）蛋白质内含子片段具有核酸内切酶活性,第六节小分子RNA的调控,一、反义RNA调控,二、干扰RNA（RNAi）的调控,三、小分子时序RNAs(small temporal RNAs，stRNAs)的调节,四、微小RNA(miRNAs)的调控,1、反式作用因子/转录因子的结构特征，各部分的结构特点。2、调控蛋白DNA结合域的主要结构特征有哪些，并各举一例说明。3、说出几种DNA聚合酶II的转录因子及其识别序列和DNA结合域的结构特征。4、真核生物的基因调控有什么特点？5、真核生物翻译水平的调控因素及其过程，可以举例。6、真核生物转录前水平的基因调节主要有哪些方式？7、比较真核生物和原核生物转录水平调控与翻译水平调控的异同点。,复习思考题,
