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1、细胞生物学Cell Biology,主讲教师：陈原国联系方式：3785911，枣庄学院生命科学学院,第七章真核细胞内膜系统、蛋白质分选与膜泡运输,细胞内膜系统(endomembrane system)：真核细胞的细胞质内具有的结构、功能和发生上相互联系的膜围绕的细胞器构成的区室化结构(compartmentalization)。主要包括内质网、高尔基体、溶酶体、胞内体和分泌泡等，由膜围绕的细胞器或细胞结构。细胞内部被膜分为3类结构：细胞内膜系统，细胞质基质(cytoplasmic matrix)、其它由膜包被的各种细胞器：线粒体、叶绿体、过氧化物酶体和细胞核。,第七章真核细胞内膜系统、蛋白质分
2、选与膜泡运输,第一节细胞质基质的涵义与功能第二节细胞内膜系统及其功能第三节细胞内蛋白质的分选与膜泡运输复习题,Membranes divide the cytoplasm of eukaryotic cells into distinct compartments.Three categories compartments in eukaryotic cells:(1)the cytosol.(2)the endomembrane system:ER,Golgi complex,Lys.,secretory vesicles.(3)mitochondria,chloroplasts,perox
3、isomes,and the nucleus.,第一节细胞质基质的涵义与功能,细胞质基质(cytoplasmic matrix or cytomatrix)：在真核细胞的细胞质中，除去可分辨的细胞器以外的胶状物质。细胞质基质体积约占细胞质的一半。一.细胞质基质的涵义二.细胞质基质的功能,肝细胞中细胞质基质及其它组分的数目及所占体积比,一.细胞质基质的涵义,细胞质基质完成了细胞与环境，细胞内各结构间物质运输、能量交换、信息传递等，及很多重要中间代谢反应。曾用名：细胞液(cell sap)，透明质(hyaloplasm)，胞质溶胶(cytosol)等。细胞质基质的主要成分：与中间代谢有关的数千种酶
4、类 维持细胞形态和胞内物质运输有关的细胞质骨架结构对细胞质基质认识：从酶溶液，到高度的组织体系。细胞质基质研究困难的主要原因：细胞破裂，甚至在稀释溶液中，通过弱键互作处于动态平衡的结构体系就会遭到破坏。细胞质基质与胞质溶胶的比较(实验证明)对细胞质基质的两种研究观点,胞质溶胶与细胞质基质：胞质溶胶(cytosol)：用差速离心的方法分离细胞匀浆物中的各种细胞组分，先后除去细胞核、线粒体、溶酶体、高尔基体和细胞质膜等细胞器或细胞结构后，存留在上清液中的成分，主要是细胞质基质的成分。细胞质基质(cytoplasmic matrix or cytomatrix)：细胞内形成的粘稠胶体，蛋白质含量约占
5、2030，多数水分子以水化物形式紧密地与蛋白质和其它大分子表面极性部位结合，仅部分水分子游离态存在，起溶剂作用。众多蛋白在细胞骨架和游离水分子间形成凝聚和溶解的动态平衡。即细胞质基质中多数蛋白质，多不是以溶解状态存在。胞质溶胶与细胞质基质溶液成分比较实验,胞质溶胶与细胞质基质溶液成分比较：乳胶小球实验 Paine将乳胶小球用显微注射方法注入非洲爪蟾卵母细胞，一段时间后取出乳胶小球，聚丙烯酰胺双向凝胶电泳分析渗入小球中的蛋白质。发现细胞质基质80%多肽未扩散到乳胶小球中。说明结合在细胞质基质中的蛋白不容易渗入乳胶小球。细胞质基质高度组织性的实验证明：用免疫荧光技术显示了与糖酵解过程有关的一些酶结
6、合在微丝上，在骨骼肌细胞中则结合在肌原纤维的某些特殊位点上。,1.一些学者：细胞质基质主要是由微管、微丝和中间丝等形成的相互联系的结构体系。即细胞质骨架贯穿细胞质基质中。细胞质基质中多数的蛋白质直接或间接地与骨架结合，或与生物膜结合，从而完成特定的生物学功能。2.另一些学者，将细胞质骨架排出在细胞质基质概念之外。,二.细胞质基质的功能：担负一系列重要的功能。,1.进行许多物质中间代谢过程。如糖酵解过程，磷酸戊糖途径，糖醛酸途径，糖原、蛋白质、脂肪酸的合成，部分生物大分子分解等。细胞质基质中，底物和产物定向转运等机制了解有限。2.多种信号通路在细胞质中形成信号网络及对话。第八章3.蛋白质在细胞质
7、基质中的分选及转运。第六、七章 根据蛋白自身所带信号运送到线粒体、叶绿体、过氧化物酶体(微体)、细胞核，或定于细胞质基质。4.细胞质骨架的功能：维持细胞形态、细胞运动、细胞内物质运输、能量传递、细胞质基质中细胞器和其它成分的锚定等。完成细胞结构的三维定位。第九章5.对蛋白质修饰、选择性降解、正确折叠等作用。,“Road map”of protein traffic,1.Gated2.TransmembraneVesicular基质中蛋白转运,Summary0f proteinsynthesisand transport,*Gated transport*Transmembrane transp
8、ort*Vesicular transport,*,*,*,*,*,Cotranslational translocation,Posttranslation translocation,5.细胞质基质对蛋白质修饰、选择性降解、正确折叠等方面的作用。（1）蛋白质的修饰（2）控制蛋白质的寿命（3）降解变性和错误折叠的蛋白质（4）帮助变形或错误折叠的蛋白重新折叠，形成正确的分子构象。,（1）蛋白质的修饰细胞质基质中发生的主要蛋白质修饰类型：辅酶或辅基与酶的共价结合。磷酸化与去磷酸化，以调节很多蛋白质生物活性。糖基化。哺乳动物，N-乙酰葡萄糖胺(Nacetyl-glucosamine)加到蛋白质中S
9、er羟基。甲基化。细胞骨架蛋白和组蛋白等蛋白质N-端甲基化，以维持其较长寿命，不易被蛋白酶水解。酰基化修饰。最常见一类内质网合成的跨膜蛋白，在内质网和高尔基体的转运过程中，把软脂酸链共价地连接在跨膜蛋白的细胞质基质侧的结构域。另一类发生在诸如src和ras癌基因产物上，将脂肪酸链共价地结合到蛋白质特定位点。如src基因编码的酪氨酸蛋白激酶，与豆蔻酸共价结合，才能转移并靠豆蔻酸链结合到细胞质膜上，完成细胞转化。,（2）控制蛋白质寿命：细胞质蛋白大多寿命数天到数月胞质蛋白序列中决定其寿命的信号：N-端第一个Aa，若是Met、Ser、Thr、Ala、Val、Cys、Gly或Pro，则蛋白质稳定；如是
10、其它12种Aa之一，则不稳定。每种蛋白质合成后不久，N-端Met(细菌为甲酰Met)被特异氨基肽酶水解除去；然后由氨酰-tRNA蛋白转移酶(aminoacyl-tRNA-protein transferase)把一个信号Aa加N-端，决定蛋白质稳定性。降解机制：依赖泛素的降解途径(ubiquitin-dependent pathway)识别蛋白质N-端不稳定Aa信号，并降解。,泛素：76Aa小分子蛋白，主要作用是识别要被降解蛋白质。依赖于泛素的26S蛋白酶体(proteosome)：结构：一个筒状20S催化核心(core，14种多肽，28个亚基)，两端各一个19S调节部分(cap，15个亚基)
11、。含量：占细胞蛋白总量1。存在：细胞质基质和细胞核。蛋白质的泛素化过程,蛋白质的泛素化过程：三步ATP供能，泛素C端与非特异性泛素活化酶E1的Cys共价结合，形成E1-泛素复合物。再将泛素转移给泛素结合酶E2。特异性泛素蛋白连接酶E3完成靶蛋白与泛素连接(E2也可将泛素直接转移到靶蛋白的Lys)。每次添加一个泛素，多个泛素结合到含不稳定Aa的蛋白N-端。26S蛋白酶体将蛋白完全水解。,蛋白质降解过程：多个泛素分子共价结合到含不稳定Aa的蛋白质N-端；26S蛋白酶体将蛋白质完全水解。,N-寡糖酶(N-glycanase或PNGase)：可切除错误折叠糖蛋白上的N-寡糖链，并可与内质网关联降解(e
12、ndoplasmic reticulum-associated degradation,ERAD)途径中的多种关键成分相结合。,（3）降解变性和错误折叠的蛋白质 不管其N-端Aa是否稳定，胞质基质中非正常蛋白，也会很快被清除。推测原因：畸形蛋白质暴露出的氨基酸疏水基团的识别，由此启动对蛋白质N-端第一个Aa的作用，形成了N-端不稳定Aa，依赖于泛素蛋白降解途径彻底水解。,（4）帮助变性或错误折叠的蛋白质重新折叠，形成正确的分子构象 主要依靠：热休克蛋白(heat shock protein 或称stress-response protein，hsp，molecular chaperones分子
13、伴侣)。热休克蛋白分3个家族：25kD，70kD和90kD表达时期：有些在正常条件下表达；有些则在异常时大量表达，以保护细胞，减少 异常环境的损伤。修复机制：热休克蛋白选择性与畸形蛋白质结合形成聚合物，利用水解ATP，使聚集的蛋白质溶解，并进一步折叠成正确构象的蛋白质。,分子伴侣（molecular chaperones）细胞中的某些蛋白质分子可以识别正在合成的多肽或部分折叠的多肽并与多肽的某些部位相结合，从而帮助这些多肽转运、折叠或装配，这类分子本身并不参与最终产物的形成，因此称为分子伴侣。,分子伴侣（molecular chaperones）和折叠酶（folding enzymes,fol
14、dases)：GroEL-GroES分子伴侣系统对于新合成蛋白的折叠是非常重要的。这两种蛋白质组成了一个由两个穴（GroEL）和一个盖子（GroES）组成的圆柱，底物进入这个圆柱，进行折叠，然后释放。,第二节细胞内膜系统及其功能,细胞内膜系统(endomembrane system)的研究方法：电镜技术(超微结构)；免疫标记和放射自显影技术(功能定位)；组分离心技术(组分分析)；遗传突变体分析(膜泡运输和功能机制研究)一.内质网的形态结构与功能二.高尔基体的形态结构与功能三.溶酶体的形态结构与功能 ER相当于物质供应站，Golgi为集散中心。,一.内质网(endoplasmic reticul
15、um,ER)的形态结构与功能,(一)内质网形态结构1.内质网发现2.内质网形态、结构和发生3.内质网类型(二)内质网功能1.蛋白质的合成(rER主要功能)2.脂质的合成(sER合成)3.蛋白质的修饰与加工4.新生多肽的折叠与组装5.其它功能(三)内质网与基因表达的调控,1.内质网的发现：1897年，Garnier：动质(ergastoplasm），可被碱性染料显色；1945年,K.R.Porter等初次观察到，并命名为内质网(endoplasmic reticulum,ER)；1954年,Palade和Porter等,证实内质网是由膜围绕的囊泡所组成。,2.内质网形态结构和发生 封闭管状或扁平
16、囊状膜系统及其包被的腔，形成互相沟通的三维网络结构。一端通过与核膜联系，另一端沿微管向外延伸。结构稳定性：细胞周期内，经历解体与重建，变化复杂；不同类型细胞、同一细胞在不同发育阶段和生理状态，其结构也有明显变化。发生：可能起源于细胞质膜，与核膜同源；自我组装，rER合成膜蛋白、sER合成膜脂。,大小通常占细胞膜系统一半，体积占细胞总体积10以上。,3.内质网分类(根据结构与功能)糙面内质网rER：扁囊状，与核糖体形成复合结构。主要功能：合成分泌性蛋白和膜蛋白。(分泌细胞发达)易位子(translocon)：多肽Sec61p等形成的蛋白复合体。直径约8.5nm，中心有2nm通道。功能为新合成多肽
17、进入内质网通道。光面内质网sER：小管、小囊状。主要功能：脂类合成；作为出芽位点，将合成的蛋白质或脂类转移到高尔基体内。在固醇类激素合成细胞和肝细胞发达。两者差异研究实验：密度梯度离心。,微粒体（microsome）,微粒体(microsome)：即破碎的内质网，生物化学家从细胞质中分离出的结构。微粒体用途：体外实验中，用于上述功能的分析研究。因其仍具有蛋白质合成，蛋白质糖基化和脂类合成等内质网的基本功能。,Electron micrograph of rough ER microsomes,密度梯度离心技术：6肝细胞中的光面内质网和粗面内质网，发现粗面内质网上有20余种与光面内质网上不同的蛋
18、白质。因此，内质网膜上可能有某些特殊的装置，将光面内质网与粗面内质网的部位间隔开来，并维持其形态。否则膜上成分将趋于侧向扩散平衡。,4.内质网分布、定位与进化：内质网膜有时向外与内折叠的细胞质膜相连接，内质网可能由细胞质膜演化而来。内质网膜常向内与外层核膜连接，内质网腔与核周隙相沟通，外核膜有时附着大量的核糖体，反映了核-质间的物质交换和内质网与核膜在发生上的同源关系。推测内质网一端固定在核膜上，另一端在一种微管马达蛋白驱动蛋白（kinesin）的牵引下沿微管向外延伸形成复杂的网状结构。光面内质网与高尔基体在结构、功能与发生上的关系密切。合成旺盛的细胞，粗面内质网与线粒体紧密相依，线粒体为内质
19、网能量的“供应站”；同时，两细胞器间还发生脂类相互交换及Ca2+释放调节。,1.蛋白质合成：均起始于细胞质基质，一些核糖体起始蛋白质合成不久，便转移至内质网膜上，再进行合成。共翻译转运的蛋白类型,蛋白合成和转移,Co-translational transportacross ER membrane!,post-translational transport,共翻译转运（Cotranslational translocation）蛋白质类型：（1）胞外分泌蛋白：分泌泡形式胞吐到胞外。（2）膜整合蛋白：细胞质膜、内质网、高尔基体和溶酶体的膜蛋白等，具有方向性。（3）内膜系统细胞器内的可溶性驻留蛋
20、白：需要与其它细胞组分严格隔离，如溶酶体与植物液泡中酸性水解酶等。,How does ER signal peptide direct the ribosome to the ER membrane?,当信号肽从核糖体中伸出，信号识别颗粒(signal recognition particle,SRP)就结合到信号肽上，肽链暂停延伸 SRP与内质网膜上的内在蛋白受体（停泊蛋白）结合核糖体与内质网膜上的易位子（translocon）结合，肽链又开始延伸SRP脱离信号肽和核糖体，返回细胞质基质重新使用信号肽被信号肽酶切除,内质网内的可溶性蛋白质合成,信号识别颗粒,信号识别颗粒受体,易位子,信号肽酶
21、,信号序列,可溶性蛋白质,信号肽识别颗粒:由6种多肽和一个7S的RNA组成，分子量325000,信号肽序列结合位点,SRP受体结合位点,翻译停止区,内质网膜上的移位子（translocon）为蛋白复合体，直径约8.5nm，中心有一个直径为2nm的“通道”，其功能与新合成的多肽进入内质网有关。在哺乳动物细胞中，移位子的主要成分是与蛋白分泌相关的一种多肽Sec61p等组成复合物。,2.脂质的合成：包括磷脂和胆固醇等几乎全部的膜脂。磷脂的合成合成磷脂的转位合成磷脂的转运方式,磷脂的合成:脂酰胆碱的合成为例所需的3种酶：酰基转移酶、磷酸酶和胆碱磷酸转移酶。活性部位：内质网膜胞质基质侧；合成底物来源：细
22、胞质基质。第一步增大膜面积；第二、三两步确定新合成磷脂种类。,脂质的转位：新合成磷脂几分钟后，转向内质网腔面，速度比自然转位高105倍。原因：借助磷脂转位因子(phospholipid translocator)或称转位酶(flippase)。其中，胆碱磷脂的转位能力强于对含丝氨酸、乙醇胺和肌醇磷脂。,脂质的转运方式：两种（1）出芽：高尔基体，溶酶体，细胞膜中。（2）水溶性磷脂转换蛋白(phospholipid exchange proteins，PEP)：线粒体、叶绿体、过氧物酶体中。PEP具专一性，运载特定种类磷脂。转运模式：PEP与磷脂分子结合形成水溶性复合物细胞质基质自由扩散靶膜PEP
23、将磷脂释放、安插于靶膜。,3.蛋白质的修饰和加工 主要化学修饰作用包括：（1）N-连接的糖基化（2）酰基化 发生部位：内质网胞质侧，或高尔基体、膜蛋白向细胞质膜转移的过程中。作用方式：常以软脂酸共价结合于跨膜蛋白Cys。（3）蛋白质二硫键形成(同后面4),蛋白二硫键异构酶,（1）N-连接的糖基化发生位置：内质网腔面。膜上糖基转移酶(glycosyl tranferase)作用下，将寡糖基链由膜内磷酸多萜醇转移到糖基化有关蛋白Asn。,真核细胞中蛋白质糖基化修饰的类型：两大类 N-连接糖基化：开始于内质网，N-乙酰葡萄糖胺连接到跨膜蛋白Asn。O-连接糖基化：发生于高尔基体，N-乙酰半乳糖糖胺连
24、接到Ser、Thr或胶原纤维中羟赖氨酸或羟脯氨酸羟基。,寡糖链由14个糖分子构成：2个N-乙酰葡萄糖胺，9个甘露糖 3个葡萄糖,X为除Pro以外的任何氨基酸,rER内糖蛋白在被运送到高尔基体前，切除了寡糖链上的3个葡萄糖分子和1个甘露糖分子,糙面内质网上的N-连接蛋白质糖基化过程：,4.蛋白质折叠和组装：数十秒或数分钟新合成多肽，还需在内质网停留几十分钟进行折叠和修正。蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI)加快新合成蛋白的正确折叠 结合蛋白(binding protein,Bip)识别重组装不正确蛋白 错误折叠多肽的降解内质网驻留蛋白的序列特征：PD
25、I和Bip等都具有4肽信号(KDEL或HDEL，Lys/His-Asp-Glu-Leu)，保证其滞留/返回内质网中，并维持高浓度。,错误折叠多肽的降解（无法修复蛋白）：移位子复合物(Sec61p复合物)转运内质网内错误多肽细胞质基质泛素依赖降解途径proteasome降解，寿命530 min(先除去糖分子，再降解),蛋白二硫键异构酶（protein disulfide isomerase，PDI）：发生位置：内质网膜腔面。功能：加快新合成蛋白的正确折叠，切断不正确二硫键，重新形成正确二硫键，并帮助折叠与组装，形成自由能最低的正确构象。,结合蛋白（binding protein,Bip）识别重组
26、装不正确蛋白：Bip属于Hsp70(热休克蛋白)家族成员。位置：内质网膜内；可与Ca2+结合桥连带负电的磷脂头部基团，使Bip结合于内质网膜。功能：识别不正确折叠或未组装好蛋白亚基(疏水部分外露，易发生聚集)，并促进重新折叠与组装，形成正确构象或组装完成，新生成蛋白与Bip分离。,5.其它功能（光面内质网）（1）合成外输性脂蛋白颗粒：肝细胞含丰富光面内质网。（2）解毒功能：肝细胞光面内质网含一些酶，可清除脂溶性废物和代谢产生的有害物质。如，细胞色素P450(多功能氧化酶mixed-function oxidase)催化各种脂溶性物质化合物羟基化或单加氧反应。（3）合成固醇类激素：睾丸间质细胞光
27、面内质网丰富，含有制造胆固醇，并进一步产生固醇类激素的系列酶。（4）储存Ca2+功能：肌细胞的肌质网(sarcoplasmic reticulum)为特化的光面内质网，其膜上Ca2+-ATP酶将细胞质基质中的Ca2+泵入肌质网腔中，通过钙结合蛋白(30 Ca2+/每蛋白分子)储存起来。（5）还有物质的储存、运输，能量、信息传递、细胞的支持和运动等功能。,内质网是细胞内除核酸以外一系列重要的生物大分子，如蛋白质、脂类和糖类合成的基地。原核细胞由细胞质膜代行其类似功能。,（三）内质网与基因表达的调控 多种蛋白在内质网中折叠、组装、加工、包装，及向高尔基体转运，需要有一个精确调控的过程。三种调节核内
28、特异基因表达的从内质网核的信号转导途径：（1）内质网腔内未折叠蛋白的超量积累。（2）折叠好的膜蛋白的超量积累。（3）网膜上膜脂成份的变化主要是固醇缺乏。这些变化可通过不同的信号转导途径诱导不同的基因活化，以保证内质网正常行使其功能。,二.高尔基体的形态结构与功能（Golgi body,Golgi apparatus，Golgi complex）,高尔基体的发现及确认（一）高尔基体的形态结构与极性（二）高尔基体的功能,高尔基体的发现:1898年，意大利医生Camillo Golgi用镀银法首次在神经细胞内观察到一种网状结构，命名为内网器（internal reticular apparatus）
29、。高尔基体的存在经半个世纪才确认，并明确普遍存在。原因：光学显微镜的局限性；高尔基体的自身结构特征：由大小不一、形态多变的囊泡体系组成；很难分离与纯化；动物细胞中数目较少(肝细胞较丰富仅50个左右)。,（）3高尔基体的形态结构与极性高尔基体形态特征：48个扁平囊呈弓形或球形堆叠(saccules,直径1m,囊间距1530nm)，周围有大小不等的囊泡。高尔基体的极性高尔基体结构：相互联系的3个部分，又可分为更精细的间隔。1.顺面膜囊或顺面管网状结构(cis Golgi network，CGN)2.中间膜囊（medial Golgi）3.反面膜囊及反面管网状结构（trans Golgi and t
30、rans Golgi network TGN）高尔基体周围的囊泡各膜囊层间联系：均由膜性结构连接；膜囊周缘囊泡可能由膜囊出芽形成，负责膜囊间物质运输。,高尔基体的极性：（1）细胞中的位置和方向：位置：较恒定。非极性细胞中，分布于微管组织中心(MTOC)负端，周围有微丝、微管的马达蛋白，和血影蛋白网架。方向：顺面(cis face，形成面，凸面）反面(trans face，成熟面，凹面）（2）物质运输：经各不相同各层膜囊，一侧进入，另一侧输出。（3）生化极性：细胞化学反应(组织化学染色)结合电镜分析，各膜囊具有不同的特有成分。,种常用标志电镜细胞化学反应的成分差异性分析：（1）嗜锇反应：经锇酸浸
31、染后，cis面膜囊特异性染色；（2）烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸酶（NADP酶）或甘露糖苷酶反应：中间几层扁平囊的标志反应；（3）焦磷酸硫胺素酶（TPP酶）反应：特异性显示trans面的12层膜囊；,A.Stained for Cis-Golgi、B.Stained for medial-Golgi、C.Stained for Trans-Golgi*锇酸染色 甘露糖苷酶染色 核苷酸二磷酸酶染色,（4）胞嘧啶单核苷酸酶（CMP酶，溶酶体标志酶）或核苷酸二磷酸酶的反应：显示靠近trans面的一些膜囊和管状结构。即GERL结构。也可用C5/6-NBP/DMB-神经酰胺标记。60年代初，Novikoff发
32、现CMP酶和酸性磷酸酶存在的高尔基体的一侧，称GERL，意为与高尔基体（G）密切相关，但为内质网（ER）一部分，又参与溶酶体（L）生成。当时认为溶酶体中的酶是内质网合成后，通过GERL而不经过高尔基体进入溶酶体。,A.Stained for Cis-Golgi、B.Stained for medial-Golgi、C.Stained for Trans-Golgi*锇酸染色 甘露糖苷酶染色 核苷酸二磷酸酶染色,1.顺面膜囊或顺面管网状结构，CGN，cis膜囊：膜厚约6nm，略薄，与内质网膜厚度接近。形态：呈中间多孔而连续分支状管网结构的扁平膜囊。主要功能：接受ER新合成物质，分类后，大部分转入
33、中间膜囊，小部分蛋白质(KDEL或HDEL)与脂类再返回内质网。其它生物活性：蛋白上Ser发生O-连接糖基化；跨膜蛋白在细胞质基质一侧结构域酰基化；日冕病毒组装。,2.中间膜囊medial Golgi 形态：扁平膜囊与管道组成，形成不同间隔，功能上是连续的、完整的膜囊体系。主要功能：多数蛋白糖基修饰、糖脂形成，及多糖合成。,3.反面膜囊及反面管网状结构trans Golgi and trans Golgi network，TGN 形态：反面最外层扁平膜囊，及伸向胞质管网和连接囊泡。主要功能：参与蛋白质分类与包装，及输出(“瓣膜”作用)；某些“晚期”蛋白质修饰：如，半乳糖()-2,6位唾液酸化、
34、蛋白质Lys硫酸化、蛋白原水解加工等。,不同细胞器结构常用的荧光染料：线粒体适用的荧光探针较多，如Mitotracker、DA SPMI、DA SPEI、JC-1、Rhodamine 123等。高尔基复合体常用的荧光探针有NBD ceramide、BODIPY ceramide、C5-DMB-ceramide。内质网主要用Dil、DiOC6(3)。溶酶体的荧光探针有DAMP、neutral red。有报道选用NBC-PC标记细胞膜、Mitotracker标记线粒体、Hoechst 33342标记细胞核DNA，同时显示细胞的三部分结构。,高尔基器的荧光照片,Typical plant cell
35、has hundreds of individual stacks dispersed throughout cell,Golgi is polarized in animal cells,高尔基体周围的囊泡（1）顺面一侧的囊泡：可能是内质网与高尔基体间物质运输小泡，称为ERGIC(endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment)，或称VTCs(Vesicular-tubular clusters)。标志蛋白：ERGIC53/58蛋白，有与甘露糖结合特性的凝集素；推测功能分泌蛋白早期起分选、包入特定囊泡。（2）反面一侧体积较大的分泌泡和
36、颗粒：功能将经过分类与包装的物质运送到细胞特定的部位。,（二）高尔基体的功能 主要功能：(1)将内质网合成蛋白质(连同脂质)加工、分类与包装，分门别类地运送到细胞特定的部位或分泌到胞外。(2)胞内糖类合成工厂。Golgi是细胞内大分子运输的一个主要交通枢纽。1.高尔基体与细胞的分泌活动 2.蛋白质的糖基化及其修饰 3.蛋白酶的水解和其它加工过程 高尔基体功能小结,1.高尔基体与细胞的分泌活动(1)实验证实：高尔基体与细胞分泌性蛋白分泌关系(2)高尔基体对蛋白质的分类与转运机理研究 例，溶酶体所有酶的共同标志6-磷酸甘露糖（M6P）内质网合成蛋白多为糖蛋白：包括溶酶体水解酶、多数细胞质膜膜蛋白和
37、分泌蛋白。细胞质基质和细胞核中蛋白质多数无糖基化修饰或仅简单糖基化修饰。内质网合成蛋白是否都通过糖基识别完成分选运输？,实验证实Golgi与细胞分泌性蛋白关系 1970年代初，Caro用3H-亮氨酸脉冲标记胰腺的腺泡细胞，显示分泌性蛋白在胞内合成与转运途径：3分钟后，放射自显影银粒主要位于内质网；20分钟后，出现在高尔基体；120分钟后，位于分泌泡，开始在顶端释放。此种转运途径运送物质：还包括细胞质膜蛋白、溶酶体酸性水解酶及胞外基质等。,例，溶酶体酶的转运：共同标志6-磷酸甘露糖(M6P)60年代发现，70年代证明，80年代纯化了反应有关酶及M6P受体。溶酶体酶在内质网合成时，发生了N连接糖基
38、化修饰(Asn加寡糖链)。溶酶体酶形成多位点M6P，增加与6-磷酸甘露糖受体(Golgi反面膜囊)亲和力，实现局部浓缩。（N-乙酰葡萄糖胺磷酸转移酶单基因突变引起的I细胞疾病）,rER内糖蛋白在被运送到高尔基体前，切除了寡糖链上的3个葡萄糖和1个甘露糖。,细胞内含物病（inclusion-cell disease，I-cell disease）：一种更严重的贮积症，由N-乙酰葡糖胺磷酸转移酶单基因突变引起，高尔基体中加工的溶酶体前酶上不能形成M6P分选信号，酶被运出细胞（default pathway）。这类病人成纤维细胞的溶酶体中没有水解酶，导致底物在溶酶体中大量贮积，形成所谓“包涵体（in
39、clusion）”。但这类病人肝细胞中有正常溶酶体，说明溶酶体形成还具有M6P之外的途径。,内质网合成蛋白是否都通过糖基识别完成分选运输？糖基识别的特异反应，仅发生于溶酶体酶。多数蛋白质的分选信息仅存在于编码蛋白质基因本身。例，一些膜蛋白在内质网上存在于细胞质基质一侧的双酸分选信号(Asp-x-Gln或DxE)，对由内质网向高尔基体转运起重要的作用。,另外发现，小分子G蛋白(GTP binding regulatory protein,G protein)Rab调节Golgi囊泡转运。,流感病毒和水泡性口炎病毒同时感染上皮细胞 流感病毒(HA)包膜蛋白特异性转运上皮细胞游离端质膜。水泡性口炎病
40、毒(VSV)包膜蛋白特异性转运上皮细胞基底面质膜。两基因同时在上皮细胞表达，与分别表达分布相同。水泡性口炎病毒(VSV)包膜蛋白特异性转运与其Golgi胞质基质侧双酸分选信号(Asp-X-Gln或DXE)起重要作用。,2.蛋白质的糖基化及其修饰，和糖脂与多糖的形成 糖基化组装途径模式：糙面内质网合成蛋白大多在内质网和高尔基体中发生糖基化和有序加工与修饰；不同的单糖残基或寡糖链和相应的糖基转移酶均位于特定间隔，形成一个组装流水线。蛋白质糖基化的原因 蛋白质糖基化的类型：（1）N-连接糖基化（2）O-连接的糖基化，两者的比较：相同点：糖基化最后一步与复杂N-连接糖基化相同，在Golgi体反面膜囊或
41、TGN，加唾液酸残基，10min运达目的地；所有加工相关的酶均为整合膜蛋白，且其活性部位均位于Er或Golgi腔面。（3）蛋白聚糖（4）糖脂（5）多糖形成,为什么蛋白质要糖基化?有利于高尔基体分类和包装，保证糖蛋白在内膜系统单方向转移。影响多肽构象，保证正确折叠。衣霉素(tunicamycin)阻断蛋白糖基化，导致其内质网滞留。增强糖蛋白稳定性，对蛋白酶抗性。成纤维细胞分泌纤连蛋白(fibronectin)。影响蛋白质水溶性和带电荷性质。保护细胞表面膜蛋白免于其他大分子接近（选择性识别），既有刚性又有弹性。,（1）N-连接糖基化根据糖链结构特征可分为两种：高甘露糖N-连接寡糖(high man
42、nose N-linked oligosacchiride)，只含N-乙酰葡萄糖和甘露糖，复杂N-连接寡糖(complex N-linked oligosacchiride)，除含N-乙酰葡萄糖和甘露糖，还含岩藻糖、半乳糖和唾液酸 最后形成成熟糖蛋白寡糖链，都含2个N-乙酰葡萄糖胺和3个甘露糖残基。复杂N-连接寡糖在rER和Golgi各间隔转移加工过程,Glycosylation in the Golgi apparatus,Core region,Complex oligosaccharide,High mannose oligosaccharide,rER内糖蛋白在被运送到高尔基体前，切除
43、了寡糖链上的3个葡萄糖和1个甘露糖。,糖基转移定位：特定三肽序列的天冬酰胺残基(Asn-X-Ser/Thr，X为除Pro以外氨基酸),寡糖链构成：14个糖分子2个N-乙酰葡萄糖胺，9个甘露糖，3个葡萄糖,Glycosylation in the Golgi apparatus,ER内的糖基化修饰和加工除去3个葡萄糖1个甘露糖,Golgi内除去3个甘露糖,Golgi内添加1个N-乙酰葡萄糖,Glycosylation in the Golgi apparatus,此后，10min内转送到目的地,糖基化组装途径模式：相关催化酶的分布：均为整合膜蛋白，固定于不同间隔，活性部位均位于Er或Golgi腔
44、内。甘露糖转移酶存在rER，半乳糖或岩藻糖转移酶存在于Golgi反面膜囊，唾液酸转移酶存在于Golgi反面膜囊和TGN。(电镜放射自显影或不同寡糖链合成抑制剂法显示)底物载体蛋白(介导反应底物核苷酸单糖对向协同运输从细胞质基质转运到Golgi囊腔内)的分布：也存在于不同间隔膜上，以维持腔内特定区域特定反应底物的浓度和特异反应。不同间隔中，寡糖链的合成与加工象一条组装流水线。,(2)O-连接的糖基化：寡糖成分和结构、合成与加工的方式完全不同。,N-连接与O-连接的糖基化比较,（3）蛋白聚糖形成：Golgi中，有多个糖胺聚糖通过木糖O-连接到核心蛋白丝氨酸上。（4）糖脂的糖基化：糖脂的糖侧链也以糖
45、蛋白相同的途径和方式合成与加工，由Golgi转运到溶酶体膜或细胞质膜上。（5）多糖形成：植物细胞中，Golgi合成和分泌多种多糖，至少含12种以上单糖，多数多糖呈分支状且有很多共价修饰，复杂于动物细胞。估计构成植物细胞典型初生壁的过程涉及数百种酶：多数酶都存在于内质网和高尔基体中。少数酶共价结合于细胞壁，如多数植物细胞的纤维素是由细胞质膜外侧的纤维素合成酶合成。,3.蛋白酶的水解和其它加工过程（1）蛋白酶的水解蛋白质在高尔基体中酶解加工的方式可归纳为四类：1）无生物活性的蛋白原(proprotein)：将N-端或两端序列切除而成熟。如胰岛素、胰高血糖素及血清蛋白。2）含有多个相同氨基酸序列的前
46、体：水解成同种有活性的多肽。如神经肽(neuropeptides，5肽)等。3）含有不同信号序列的蛋白分子前体，可加工成不同产物；或同一种蛋白前体在不同细胞，最后加工成不同产物。不同的多肽采用不同的加工方式的原因（推测）（2）硫酸化作用：主要为蛋白聚糖在高尔基体内组装。硫酸根供体：3-磷酸腺苷-5-磷酸硫酸(3-phosphoadenosine-5-phosphosulfate，PAPS)，从胞质基质中转入高尔基体膜囊内，酶催化，将硫酸根转移到肽链Lys羟基。,不同的多肽采用不同的加工方式的原因（推测）：有些多肽分子太小，在核糖体上难以有效地合成，如5Aa神经肽；有些可能缺少包装并转运到分泌泡
47、中的必要信号；可以有效地防止这些活性物质在合成它的细胞内起作用。例，胰岛素、消化酶等。,高尔基器的功能分区,溶酶体蛋白质上的寡糖链被磷酸化进一步修饰 来自内质网的 N-linked的糖分子（除去甘露糖，除去甘露糖和添加N-乙酰葡萄糖，添加半乳糖和唾液酸）新合成 O-linked的糖分子 酪氨酸和碳水化合物被硫酸化NOTE:Data shows that processing occurs in a spatial as well as a biochemical sequence.,高尔基体的功能,蛋白质的糖基化加工：形成O-连接的糖苷键；进一步加工N-连接的糖苷键。分选包装和分泌活动合成和分
48、泌多糖，并参与细胞壁的形成细胞内的膜泡运输溶酶体的发生,三.溶酶体(及过氧化物酶体)形态结构与功能 Lysosome and peroxisome(microbody),溶酶体发现和分布（一）溶酶体的结构类型（二）溶酶体的功能（三）溶酶体的发生（四）溶酶体与过氧化物酶体,溶酶体发现：1949年，de Duve将大鼠肝组织匀浆，用差速离心方法，分析细胞组分(与线粒体共组分)，测定酸性磷酸酶活性时，分析出溶酶体的存在。1955年，de Duve与Novikoff合作首次用电子显微镜证明了溶酶体的存在。溶酶体显示：标志酶反应(酸性磷酸酶,acid phosphatase)，可辨认不同形态(多泡体、线
49、状)与大小的溶酶体；并可研究溶酶体的发生与成熟过程。分布：存在于动物细胞，约含数百个；植物细胞有功能类似的细胞器圆球体、糊粉粒及液泡(含有多种水解酶类)；原生动物细胞也存在类似溶酶体结构。,（一）溶酶体的结构类型溶酶体(lysosome)：单层膜围绕、内含多种酸性水解酶类的囊泡状细胞器。溶酶体的异质性(heterogenous)：指不同溶酶体的形态大小不同，所包含水解酶种类不同，执行生理功能不同。类型：根据所处完成其生理功能的不同阶段 初级溶酶体（primary lysosome）、次级溶酶体（secondary lysosome）、残余体（residual body）,1.初级溶酶体：（1）
50、形态：球形，直径0.20.5m，内容物均一，不含明显颗粒物质，由一层7.5nm厚的脂蛋白膜围绕。（2）结构特点：内含物：多种水解酶，如蛋白酶、核酸酶、糖苷酶、脂酶、磷脂酶、磷酸酶和硫酸酶等。溶酶体酶的共同特征：均属酸性水解酶，最适pH为5左右，pH7时即失活；都具有某些特征的同源序列；本身结构都能抗御酸变性作用。溶酶体膜成分与其它生物膜不同：嵌有质子泵：形成和维持H+浓度高出胞质100倍；具有多种载体蛋白：水解产物向外转运；膜蛋白高度糖基化：防止自身膜蛋白降解。,2.次级溶酶体：初级溶酶体与细胞内的自噬泡或异噬泡、胞饮泡或吞噬泡融合形成的复合体，为正在行使消化作用的溶酶体。分类：根据消化的对象
