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1、山东大学医学院生化与分子生物学系任桂杰,第一讲细胞周期调控与肿瘤Cell cycle regulation and tumor,1,内容介绍:,第一节 细胞周期概述第二节 细胞周期的各元素及其相互作用第三节 细胞周期调控与肿瘤,2,第一节 细胞周期概述,一、细胞周期,细胞增殖周期，简称细胞周期(cell cycle)，是指连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束开始,到下一次有丝分裂结束为止所经历的整个过程。,3,G1期：（DNA合成前期）从有丝分裂完成到DNA复制之前的一段时期；S期：（DNA合成期）为DNA复制的时期；G2期：（DNA合成后期）从DNA复制完成到有丝分裂开始的一段时期；M期：（有
2、丝分裂期）从细胞分裂开始到结束的一段时期。,1.Phases of Cell Cycle,4,2.Characteristics of Cell Cycle Phases,G1期：细胞周期的大部分时相处于G1期，动物细胞一般为6-12小时。该期主要的生化活动是合成RNA和蛋白质。S期：此期一般持续6-8小时，其长短主要由基因组的复杂度决定。该期主要的生化活动是复制DNA。,5,G2期：该期主要的生化活动是合成一些与有丝分裂有关的蛋白质。M期：该期很短，一般持续0.5-2小时。该期生化合成停止，细胞形态发生改变，一个母细胞分裂成2个子代细胞。,6,3.Checking Points of Cel
3、l Cycle,真核细胞的分裂增殖必须经过两个关键的调控点：即DNA合成开始时的G1S期的转换和有丝分裂开始时的G2M期的转换。除此之外，细胞还有G0G1期的转换，以及S期的检查点。,7,8,4.细胞周期的特点:,单向性：只能沿G1、S、G2、M方向推进。阶段性：各期细胞形态和代谢特点有明显差异，细胞可因某种原因在某时相停止下来，待生长条件适合后重新活跃到下一时相。检查点：各时相交叉处存在检查点，决定细胞下一步的增殖趋向。细胞微环境：细胞周期是否顺利推进与细胞外信号和条件等密切相关。,9,1.周期性细胞：连续分裂的细胞；始终处于增殖和死亡的动态平衡中（稳态更新），如表皮细胞、骨髓细胞。2.G0
4、期细胞：休眠细胞；暂时脱离细胞周期，适当刺激可重新进入细胞周期（条件更新）。如肝、肾细胞。3.终端分化细胞：不分裂细胞；不可逆的脱离细胞周期，丧失增值能力，但具有一定生理功能。如神经细胞、心肌细胞。,二、机体活细胞的分类,10,11,细胞周期蛋白/素(cyclin，CLN)细胞周期素依赖激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDK inhibitory protein，CKI）,第二节 细胞周期的元素及其相互作用,调节细胞周期的3类蛋白质:,12,1.周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK)-CDK1-6,是调节细胞周期的主要蛋白质，通过使其他蛋白
5、质磷酸化而驱动细胞周期进程,其活性受周期蛋白的正调控，受CKI的负调控。2.周期蛋白（cyclin)-A,B,C,D,E等，不同的周期蛋白与不同的CDK结合形成cyclin-CDK复合物，可调节细胞周期的不同阶段。3.CDK抑制蛋白（CKI)-与CDK结合后可抑制CDK的活性，可分为两大家族：CIP/KIP(p21,p27,p57等):广泛抑制多种CDK的活性。INK4家族(P15,p16,p18,p19等):特异性抑制作用。,13,CDK4/cyclin D-CDK2/cyclin E-CDK2/cyclin A-CDK1/Cyclin B,14,15,16,2001年，Leland Har
6、twell，Paul nurse和 Tim hunt因成功揭示细胞周期分子机制而共同获得第100届诺贝尔生理学与医学奖。这标志着细胞周期的研究已获得全世界的认同，为细胞周期与肿瘤的研究奠定了基础。,17,Cyclin(CLN)又称周期素，是一组结构相似,并能结合和调节细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)活性的蛋白质。,1.Structure and Function of Cyclin,18,周期素都是CDK的调节亚基，分别在细胞周期的不同时期积累，激活CDK，使其具有催化关键底物磷酸化的作用并调节底物活性。在高等真核细胞中，周期素至少分为A、B、C、
7、D、E、F、G等几大类。,19,不同的周期蛋白（cyclin A,B,C,D,E,F,G,H等）能与不同的CDK结合，可调节细胞周期的不同阶段。G1 S G2 M,D-CDK4/6,E-CDK2,A-CDK2,B-CDK1,G1期运行,S期启动,G2期启动和进行,M期启动和进行,20,G1,S,G2,M,prophase,metaphase,anaphase,telophase,Cyclin D,CDK4/6,Cyclin B,CDK1,Cyclin A,CDK2,Cyclin E,CDK2,Cyclins/CDKs in the different phases of cell cycle,
8、21,The Expressional Levels of Cyclins during Cell Cycle,22,Cyclins的时相性起伏,D,E,A,B,Cyclin的功能调控主要依靠其蛋白质水平的细胞周期特异性起伏。,23,The Relationship of Cyclin Expressional Levels with DNA Replication,24,所有Cyclin蛋白分子上都有一段与CDK结合并使之激活的保守区，称为细胞周期素盒(Cyclin box)。,25,此外，周期蛋白还含有降解盒（destruction box）或PEST序列（脯-谷-丝-苏），可通过定时降解
9、或快速转换来调节周期素的水平。,26,周期素的家族成员,27,Cyclins通过泛素-蛋白酶体途径降解,28,2.Structure and Function of CDK,CDK是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，需与相应的cyclin结合才能显示活性，故CDK称为依赖cyclin的蛋白激酶。不同阶段有相应的cyclin/CDK。,29,人们对CDK的认识，最初是通过研究培养细胞和酵母细胞而得到的。目前已经确定的CDK有：裂殖酵母中CdC2；酿酒酵母中的CdC28、PHO85、KIN28以及人类细胞中CDK110。,2.1 Types and Characters of CDK,30,脊椎动物的C
10、DK,*P35，P36的结构与细胞周期蛋白无相似性,31,CDK的分子量一般为3540kD，不同CDK的氨基酸组成有40%以上的同源性。CDK催化亚基的活性中心约由300个氨基酸残基组成，当处于单体或非磷酸化状态时，CDK没有催化活性。,32,Molecular Structure of CDK2,33,在激活因素中，目前认为CDK与周期素的结合以及保守的苏氨酸残基(Thr161)的磷酸化是较为重要的两种调节因素；而在抑制因素中，CDK的N-端氨基酸残基的抑制性磷酸化(Thr14和Tyr15)以及抑制蛋白(CKI)的结合是主要的调节因素。,2.2 Regulation of CDK Activ
11、ity,34,35,周期素的激活作用：周期素中的“周期素盒”结构域直接和CDK结合，并与CDK的激活相关。周期素的结合与激活作用主要通过周期素在细胞周期中的浓度波动来调控。,2.2.1 Activation of CDK,36,CyclinA-CDK2 Complex with ATP Bound,37,磷酸化修饰的激活作用：CDK的激活还必须依赖于其保守的苏氨酸残基的磷酸化，如在人CDK1（p34cdc2）的Thr161和CDK2的Thr160的磷酸化，就与这两个酶的激活相关。,38,催化CDK1和CDK2磷酸化的酶是CAK，催化亚基为CDK7 CAK 调节亚基为周期素H 组装蛋白因子MAT
12、1,（MAT1 CDK-activating kinase assembly factor 1）,39,Complex of CDK7-CyclinH-MAT1,40,CAK,CDK的激活机制:,CDK Thr 160/161磷酸化 CDK/Cyclin,cell cycle,41,CDK的激活和失活还与 Thr14/Tyr15 的磷酸化和去磷酸化有关。Thr14/Tyr15的去磷酸化导致CDK的激活,使其去磷酸化的磷酸酶是CDC25。,42,CDK启动cell cycle:,CDK激活,Cyclin与CDK结合,CAK对CDK Thr 160/161的磷酸化,43,磷酸化修饰的抑制作用：在人
13、的CDK1和CDK2中，Thr14和Tyr15残基的磷酸化可抑制CDK的催化活性。其原因在于上述残基的侧链位于该酶活性中心ATP结合部位的顶端。,2.2.2 Inhibition of CDK,44,催化Thr14和Tyr15磷酸化的是两种不同的蛋白激酶，使Thr14磷酸化的为蛋白激酶Myt1，使Tyr15磷酸化的是蛋白激酶Wee1/Mik1。催化Thr14和Tyr15脱磷酸化的是蛋白磷酸酶CDC25。因此，蛋白激酶Wee1和Myt1及蛋白磷酸酶CDC25的相对活性，决定CDK1和CDK2的活性高低。,45,Regulation of CDK Activity,CAK,46,抑制蛋白的作用：抑
14、制蛋白，即周期素依赖性蛋白激酶抑制子（CKI），大部分CKI都是抑癌基因的编码产物。在哺乳动物细胞中，目前已经确定的CKI主要有：P15和P16、P19、P21、P27、P53和PRb，可分别抑制各型CDK的活性。,47,P16INK4A和P15INK4B：是分别由抑癌基因INK4A/MTS1和INK4B/MTS2编码合成的蛋白质，能专一性的与CDK4和CDK6结合，并阻止其与周期素的结合反应，从而抑制其蛋白激酶活性，使细胞停留于G1期。,48,P16 CDK4 cyclinD1 一 P cdk介导的磷酸化 Rb Rb P 一 G1 S DNA转录,49,P21WAF1/CIP1：是由抑癌基因
15、WAF1/CIP1编码合成的蛋白质，几乎能与所有的周期素-CDK复合物结合，抑制其蛋白激酶活性，使细胞停留在G1期。,50,P27KIP1：是由抑癌基因KIP1编码合成的蛋白质，也能与几乎所有的周期素-CDK复合物结合，抑制其蛋白激酶活性，使细胞停留于G1期。,51,p27-cyclin-cdk complex,52,P53：由抑癌基因p53编码合成的蛋白质，是WAF1/CIP1基因（P21）的转录激活因子。因此，P53的表达可促进P21WAF1/CIP1的转录表达，从而抑制CDK的蛋白激酶活性。,53,Function of P53：,54,55,56,PRb：是由Rb抑癌基因编码合成的蛋白
16、质，有低磷酸化型和高磷酸型两种型式。低磷酸化型的PRb可与转录因子E2F形成复合体，抑制其转录激活作用，阻止细胞分裂；而高磷酸化型的PRb则不能与E2F形成复合体。催化PRb由低磷酸化型转变为高磷酸化型的蛋白激酶就是各型CDK。,57,Rb在细胞周期内的磷酸化,58,Cyclin D与CDK结合使Rb释放结合的转录因子E2F,59,60,Figure.Regulation of Rb and E2F activities in late G1.Interaction of E2Fs with nonphosphorylated Rb protein initially inhibits E2F
17、 activity.When signaling from mitogens is sustained,the resulting initiate the phosphorylation of Rb,converting some E2F to the active form,which activate target genes whose products are essential for S phase.,61,Rb function is linked to other tumor suppressors,62,小结Rb的生理作用:,Rb基因是视网膜母细胞瘤的致病基因，位于13q1
18、4。Rb蛋白p105 两种形式：磷酸化Rb和非磷酸化Rb（活性形式）Rb蛋白的作用：1.非磷酸化Rb与转录因子E2F结合，抑制其活性，使细胞停留在G1期。E2F 是很强的转录因子，可促进许多参与S期的酶和蛋白质如DNA聚合酶、胸苷激酶、二氢叶酸还原酶等的表达，增强DNA的复制，促进细胞通过G1/S控制点。2Rb 磷酸化 磷酸化的Rb释放E2F 促进DNA的合成 细胞分裂增殖。,63,3.病毒癌蛋白（SV40 大T抗原，腺病毒EIA和人乳头瘤病毒E7等）和Rb结合，释放E2F，从而促进细胞的分裂增殖和转化。4.Rb基因的突变失活（点突变，缺失或GC岛的高甲基化等）使之失去结合E2F和抑制细胞增殖
19、的能力。5.生长因子如EGF、PDGF和癌基因c-myc等都可促进cyclinD1的表达和D1-CDK4/6的形成，从而促进细胞的分裂增殖。6 CDK抑制蛋白P16是抑癌基因 P16可竞争性地与CDK4/6结合，抑制CDK4/6的活性，从而抑制细胞从G1S过渡，使细胞停留在G1期。,64,3.细胞周期调控中各元素间的相互作用 细胞周期的调控可分为外源和内源性调控.外源性调控主要是细胞因子以及其它外界刺激引起；内源性调控主要是通过CyclinCDKCKI的网络调控来实现。,65,生长信号（GF）：通过早期应答基因传递到细胞周期调控机制时,首先是cyclinD的表达增加,与CDK4/6形成复合物，
20、使细胞周期运行。抑制信号（TGF-）：促进CKI表达增加,抑制CyclinD-CDK4/6复合物的功能，使细胞阻滞在G1期。,66,67,P,Rb,E2F,D-CDK 4/6,E2F,磷酸化的Rb,EGF,PDGF,c-myc等,Cyclin-D,病毒癌蛋白与Rb结合,参与S期DNA合成的蛋白质基因的表达,细胞的过度增殖 和癌变,Rb 基因的突变,P16,突变的Rb蛋白,68,69,各种细胞周期蛋白随特定细胞时相而出现。G1早期，cyclinD表达并与CDK4或CDK6结合，成为始动细胞周期的启动子；G1晚期、进入S早期后cyclinE表达，并与CDK2结合，推动细胞进入S期；进入S期后，cy
21、clin A表达，cyclin A 和CDK2相结合可以调节S期进入G2期；S晚期、G2早期，cyclIin A、cyclin B表达，并与cdc2结合，促进细胞进入M期。,70,P53 P16 介导 抑制CDK4 p21 CDK4 cyclinD1 抑制CDK4 活化CDK4 P cdk介导的磷酸化 Rb Rb P E2F 无活性复合物 E2F启动 DNA转录 G1 S DNA转录,71,CDK活性状态是以磷酸化形式存在的。CAK可诱导CDK磷酸化（Thr161），而p27通过与CDK亚单位的结合，使CAK不能与CDK直接发生作用。非活化的CDK不能使Rb蛋白磷酸化，使细胞停留在G1期，对细
22、胞周期进行负调控。P27还可阻止Rb蛋白磷酸化，其过度表达能抑制细胞进入G1期。,72,小结:,细胞周期由一系列瀑布式的CDKs激活所驱动CDKs的激活受控于四大机制(cyclin,CAK,Weel/CDC25,CKIs)CDKs激活执行细胞周期的两大生物学功能:复制和分裂,73,第三节 细胞周期调控与肿瘤,科学家在研究中逐渐发现，几乎所有癌基因、抑癌基因的生物学效应，最终都会聚到细胞周期机制上。许多癌基因、肿瘤抑制基因直接参与细胞周期的调控，或者本身就是细胞周期调控复合体的主要成分。这些基因变异的结果，导致了细胞周期的失控，直接诱发肿瘤。,74,驱动机制,检查机制,CKI,-,肿瘤细胞恶性增
23、殖的机制,75,肿瘤细胞恶性增殖的机制,Cyclin的过表达,CDK的增多,CKI表达不足和突变,检查点功能障碍,细胞增殖过度与肿瘤,G1/S检查点功能障碍（P53突变）,G2/M检查点功能障碍,76,一、肿瘤细胞周期失控的分子基础 1细胞周期蛋白异常,G1cyclin基因突变、重排，使这些cyclin异常表达，从而使细胞通过G1期，进入S期，细胞即自发增殖，出现转化特征。许多人类肿瘤中，均发现有cyclin D1基因的扩增。,77,Cyclin D1（原癌基因Bcl-1）过表达原因:,基因扩增（Cyclin D1过表达的主要机制）乳腺癌、胃癌、食道癌存在Cyclin D1基因扩增过度。染色体
24、倒位（Chromosome inversion）Cyclin D1基因倒位于甲状旁腺启动子控制下 Cyclin D1蛋白合成 甲状旁腺腺癌 染色体易位（Chromosome translocation)Bcl-1 t(11:14)(q13:q32)易位 Cyclin D1受Ig重链基因增强子影响 Cyclin D1表达,78,【Cyclin D过表达致肿瘤机制】Cyclin D过表达+生长因子 CDKs瀑布效应 细胞增殖过度 易发生细胞癌变,基因突变Cyclin D1 T286突变 Cyclin D1泛素化受阻 Cyclin D1,79,B型肝炎病毒（hepatitis B virus,HVB
25、）感染人体后成为导致肝癌的因素之一，有研究发现，HVB基因组整合入cyclinA基因的一个内含子中，产生异常、过量表达的转录物。和正常的cyclinA相比，它缺少N端的“destruction box”，逃脱了对它的降解，大量异常的cyclinA刺激细胞增殖。,80,2CDK和CKI基因的突变 研究中发现肿瘤细胞CDK的水平一般较高，而CKI基因常见纯合性缺失突变，细胞内缺少CKI，或CKI抑制CDK功能的丧失。,CDK 表达异常主要见于CDK4、CDK6过表达。CDK4+cyclin D结合 CDK4/cyclin D pRb pRb磷酸化 细胞增殖过度 E2F G1/S过渡加速,81,82
26、,【Mechanism】p53基因突变 P21cip1转录 DNA受损细胞增殖,P21含量减少（Deficient expression of Kip/Cip）P21cipl功能 cyclins/CDKs活性 细胞周期速度 增殖细胞核抗原（PCNA）阻滞DNA复制,83,3癌基因和抑癌基因突变 不少癌细胞中发现Rb或P53基因发生了突变，使Rb失去了阻断mRNA转录，P53失去了使细胞休止在G1后期的功能，造成细胞周期失控。,84,细胞周期素与原癌基因：与G0G1期转化有关的原癌基因有myc和ras，它们在转化细胞中与cyclin D共同作用。E2F刺激c-myc和cyclin A的表达。E2
27、F释放可以进一步增加c-myc的表达，诱导cyclin E和cyclin A。cyclin ECDK的激活则依赖于ras和myc的共同作用。c-myc表达增加可防止cyclinE-CDK2灭活，允许细胞在p27存在的情况下继续增殖。c-fos高表达可下调p27水平而使cylcinE-CDK2复合物活性增强，促使细胞增殖。C-myc与ras在细胞内共表达时可使细胞内p27消失。,85,Defects of DNA checkpoints&tumor,Normal,Tumor,Tumor,86,二、细胞周期调控与肿瘤的防治策略,抑制cyclin或/和CDK的表达和活性,提高CKI的表达和活性,修复
28、有缺陷的细胞周期检查点,87,三、细胞周期与肿瘤的基因治疗 1.抑制G1期cyclins的过度表达 G1期cyclins反义核酸（RNA干扰），在体外和裸鼠体内都可抑制肺癌的增殖。反义DNA可以与基因结合而阻止基因的转录，反义的RNA可与mRNA结合，而抑制其翻译，都可以达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。,88,2.促使肿瘤细胞表达正常的CKIs有报道用正常的P16、P21、P27基因与腺病毒载体重组，将重组的腺病毒导入肿瘤细胞，重组的腺病毒在肿瘤细胞内表达有功能的P16、P21和P27蛋白，抑制CDKs的活性，使肿瘤细胞停止在G0G1，抑制肿瘤细胞增殖。,89,3.抑制E2F的活性把对E2F有高度亲和性的双链DNA片段导入细胞，该DNA能够结合游离状态的E2F生成一种复合物，复合物中的E2F不再与有关基因的启动子结合，从而阻断这些基因的表达，抑制细胞增生。,90,91,谢谢！,91,
