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1、第三章 种子扩大培养,1、种子扩大培养：将保存在砂土管，冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。这些纯种培养物称为种子。2种子培养任务：保持生产菌种的优良生产性能，得到比较纯净的种子，菌健壮，还要有足够的量，以供大规模生产用。种子培养质量的好坏，关系到发酵产物的产量、质量。3生产菌种的基本要求一个发酵产物可有多种产生菌，但产生菌不等于生产菌，作为生产菌要有一定条件和要求：,（1）高产稳产性能：合成能力高，遗传性相对稳定（遗传特性包括生产性能，生理特性，形态特性）菌种不衰退、难变异。（2）要求较粗放：较易培养，生长
2、繁殖较快，可利用比较多种的原料，此原料要求经济易得。培养快表现在发酵周期短，生产工艺简便用一般的生产方法可生产，易提炼，要有一定抗污染的能力，包括抗杂菌，抗噬菌体。（3）非病原菌：对发酵操作如此，且发酵产品用于食品，医药有很大部分，用于此类的菌还要求不产生毒素。（4）最好能耐自身代谢产物，最好可耐高、低温，可耐高温则热天可生产，省下冷却水，最好可耐酸碱。最好产生泡沫少，泡沫多，则需消耗消泡剂多，产品提炼困难。现生产菌种大多为人工长期选育的变异株（或突变体），要完全符合以上四条的很少，且其会衰退变异，因而要不断选育新的菌种。,4生产上的防止菌种的变异和衰退，采取以下措施（1）适宜的保存方法：主要
3、原理是利用低温、干燥、真空；如斜面、砂土、矿物油。（2）限制使用期：斜面1-2月移植；砂土1-2年。（3）减少传代次数，限制菌种的开启次数，为防染菌（4）定期分纯：必用单细胞或单孢子的分离，分离后的单细胞（单孢子）要进行生产能力的测定，要求不低于原有的菌种。,第一节 种子的制备过程,种子制备的过程大致可分为：实验室种子制备阶段 生产车间种子制备阶段,制备过程：实验室：保存菌种斜面上活化悬浮液（如为孢子叫孢悬液）生产车间：一级种子罐二级种子罐发酵罐 一、实验室种子制备（1）产孢子多的可用米粒 用大（小）米或玉米、麦片为原料（原料简单易得，成本低）繁殖孢子的数量较多。要严格控制灭菌的含水量。接种时
4、砂土管或冷冻管悬浮液大（小）米粒培养基成熟（亲米）大（小）米培养基培养成熟（生产米）(进种子罐)（2）产孢子能力不强或发芽慢者摇瓶得菌丝体（3）斜面活化几次摇瓶,（一）孢子的制备,1，细菌孢子的制备细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37C。细菌菌体培养时间一般为12天，产芽孢的细菌培养则需要510天。,2，霉菌孢子的制备 霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。培养的温度一般为2528C。培养时间一般为414天。,3，放线菌孢子的制备 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨
5、和一些无机盐等。培养温度一般为28C。培养时间为514天。,（二）液体种子制备,1，好氧培养：对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（S.griseus）、产卡那霉素的卡那链霉菌（S.Kanamuceticus）可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。试管三角瓶摇床种子罐,2，厌氧培养：对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）试管三角瓶卡式罐种子罐,二、生产车间种子制备,实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌
6、，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。,1，种子罐的作用：主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。,2，种子罐级数的确定 种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，生产上只有一级发酵不合算，故生产上至少要用二级发酵，但种子罐级数多，则设备多，污染的机会也多，工艺就复杂了，故也不可太多级种子罐（实验室用一级发酵）1种子罐级数的决定（1）根据生产菌的特性：生产繁殖快慢，产孢子能力大小。孢子发芽率，发芽时间。如生长繁殖快，孢子多，发芽率高，发时时间短，则级数少（2）根据发酵罐的接种量
7、：（3）发酵罐与种子罐的体积比 V发酵罐/V种子罐 比数越大，种子级数越大。,发酵罐接种量少，则级数少，接种量决定于 根据菌的生长特性（生长快接种量少），看接种菌，如细菌接种量0.1-5%，酵母菌10%，霉菌放线菌7-15%（但霉菌也有少的，如制霉菌素，Nystatir只用1%）根据种子质量：活力高则接种量少现相当多的产品采用大接种量，如庆大霉素发酵的接种量达20-25%，大接种量优点和缺点:,优点：a.可缩短发酵罐中菌的生长期，则产物合成的时间可提前，则整个合成时期就增加了，不少种子液中会有水解酶类，有利于发酵利用。b.可有效地防止发酵罐的前期染菌，有相当部分的特别是抗生素的生产，种子液中就
8、有抗生素，可利用之抑菌。缺点：a.要求种子罐多b.种子液中含代谢废物，副产物，在发酵罐中可能抑制菌的生长和产物的合成。具体接种多少要经过实验和生产检验。,细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。茄子瓶种子罐发酵罐 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液一级种子罐（27C,40小时孢子发芽，产生菌丝）二级种子罐（27C,1024小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）发酵罐 放线菌：生长更慢，采用四级发酵酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子。,确定种子罐级数需注意的问题种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率
9、，增加染菌机会虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。,第二节 种子质量的控制,一、影响孢子质量的因素及控制培养基培养条件培养时间和冷藏时间,1，培养基,生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。例如在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响也不同。原材料质量的波动，起它要作用的是其中无机离子含量不同，如微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子
10、的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。,水质的影响：地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。,措施培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用严格控制灭菌后培养基的质量斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源,2，培养条件,（1）温度 温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。如土霉素生产菌种在高于37C培养时，孢子接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等
11、现象。一般各生产单位都严格控制孢子子斜面的培养温度。,（2）湿度 制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大的影响。例如土霉素生产菌种龟裂链霉菌，孢子制备时发现：在北方气候干燥地区孢子斜面长得较快，在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干疤状，孢子稀少。在气温高含湿度大的地区，斜面孢子长得慢，主要由于试管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。从表中看出相对湿度在40%45%时孢子数量最多，且孢子颜色均匀，质量较好。,3，培养时间和冷藏时间,（1）培养时间一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢
12、子会导致生产能力的下降。措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。,（2）冷藏时间斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于4C冰箱保存，发现冷藏78天菌体细胞开始自溶。而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。例如在链霉素生产中，斜面孢子在6 C冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。,4，接种量接种量大小影响到培养基中孢子的数量，进而影响菌体的生理状况。,二、影响种子质量的因素及控制,孢子的质量培养基培养条件种龄接种量,1，培养基营养成分适合种子培养的需
13、要选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；营养上要易于被菌体直接吸收和利用；营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高营养成分要尽可能与发酵培养基相近。,2，培养条件（1）温度（2）通气量 在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的通气量可以提高种子质量。例如，青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充足和不足两种情况下得到的种子分别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种子罐的通气量小对发酵有利。,3，种龄种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培
14、养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好。,4，接种量,三、种子质量的控制措施,种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。因此首先必须保证生产菌种的稳定性，其次是提供种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入，以获得优良种子。菌种稳定性的检查无（杂菌）检查,四、种子质量标准,1，细胞或菌体菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态；霉菌、放线菌：菌丝
15、粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。,2，生化指标种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化。,3，产物生成量在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。,4，酶活力种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。,五、种子异常分析,菌种生长速度，过快或过慢 菌丝结团菌丝粘壁,第三节 实例,一、谷氨酸发酵的菌种扩大培养斜面菌种一级种子培养二级种子培养发酵罐1，斜面菌种的培养菌种的斜面培养必须有利于菌种生长而不产酸，并要求斜面菌种绝对纯，不得混有任何杂菌和噬菌体，培养条件应有利于菌种繁殖，培养基以多含有
16、机氮而不含或少含糖为原则。(1)斜面培养基组成 葡萄糖 0.1 蛋白陈 1.0 牛肉膏 1.0 氯化钠 0.5 琼脂 2.02.5 PH 7.07.2（传代和保藏斜面不加葡萄糖）(2)培养条件：3334，培养1824h,2，一级种子培养一级种子培养的目的在于大量繁殖活力强的菌体，培养基组成应以少含糖分，多含有机氮为主，培养条件从有利于长菌考虑。(1)培养基组成葡萄糖 2.5 尿素 0.5硫酸镁 0.04 磷酸氢二钾 0.1玉米浆 2.53.5(按质增减)硫酸亚铁、硫酸锰 各2ppmPH 70,(2)培养条件 用1000mL三角瓶装入培养基200mI，灭菌后置于冲程76cm、频率96次min的往
17、复式摇床上振荡培养12h，培养温度3334(3)一级种子质量要求种龄：12h pH值：6.4 0.1光密度：净增OD值0.5以上残糖：0.5以下 无菌检查：(-)噬菌体检查：(-)镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐革兰氏阳性反应。,3，二级种子培养为了获得发酵所需要的足够数量的菌体，在一级种子培养的基础上进而扩大到种子罐的二级种子培养。种子罐容积大小取决于发酵罐大小和种量比例。(1)培养基组成,(2)培养条件 接种量：0.81.0 培养温度：3234 培养时间：78h 通风量50L种子罐1:0.5搅拌转速340rmin；250L种子罐1:0.3搅拌转速300r min500L种子罐1:0.25
18、搅拌转速230r min,(3)二级种子的质量要求种龄 78h pH 7.2左右OD值 净增0.5左右无菌检查(-)噬菌体检查(-),二、啤酒酵母的扩大培养,一般可采用三级扩大培养，扩大倍数：第1级到第2级为8-10倍，第2级到第3级为4-6倍。1，实验室扩大培养,2，车间扩大培养,第三节 生产发酵罐的无菌接种,生产规模发酵罐的接种，包括两个方面：从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种入一个种子罐，从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。,从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种,从种子罐接种,第四节 菌种的保藏与复壮,一、菌种保藏的意义 菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关
19、生产如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。,二、菌种保藏的原理 菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“体眠”状态，抑制其繁殖能力。一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便生产上能推广使用。,三、菌种保藏的方法,斜面低温保藏法：酵母菌 石蜡油封保藏法：酵
20、母菌 砂土管保藏法：细菌，霉菌，放线菌 硅胶保藏法：细菌 冷冻干燥法：细菌，放线菌 液氮超低温冻结法：细菌，真菌,四、菌种的衰退与复壮,1，菌种衰退：菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。,2，菌种退化的原因：基因突变；变异菌株性状分离；诱变的单菌落是由个以上孢子或细胞形成菌落由个孢子或单个细胞形成，但它是多核细胞单核孢子发生突变时，双链DNA上仅条链上某个位点发生变化,连续传代其它因素菌种保藏不当 生长条件不满足（培养基组成、培养条件）,防止菌种退化的措施控制传代次数选择合适的培养条件选择合适的保藏方法菌种稳定性检查 分离复壮,菌种复壮：使衰退的菌
21、种重新恢复原来的优良特性。复壮措施：对已衰退菌种配合一定培养条件进行单细胞分离纯化淘汰衰退的个体选择合适的培养基,2种龄（接种龄）：即培养时间要多久的问题，如时间太短，则菌嫩，发酵速度慢，代谢活力低如时间太长，则菌老，发酵时间短，代谢活力低，微生物发酵都采用对数生长期的菌。,第二节种子质量标准和影响,一、种子质量标准不同菌，有规定一套严格的检验标准。1菌的情况（1）菌形态：要正常，包括有一定排列，菌形整齐，所以从此反映菌的生理状态。(2)（3）菌液或培养斜面的外观正常孢子层厚薄，颜色（4）无杂菌：镜检染菌严重时方可看出；,肉汤酚红；斜面：生产菌与杂菌菌落不同 发酵工业上尤其需快速检测有无杂菌。2生化指标C、N、P的利用，部分品种PH情况，培养液酶活性。3种子液中产物量 二、影响种子质量的因素1原材料质量 起主要作用的是其无机离子含量的变化2培养条件（1）温度：过高则菌丝自溶早（2）湿度：湿度太低不利于一些丝状菌生长（3）通气量：适宜（4）斜面冷藏时间：培养时间及冷藏保存时间三、注意种子质量的保护1定期检查种子生产特性，纯化复壮2无菌检查,
