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1、第六章 稳定性同位素示踪法 概述：1、1912年，Thomson首发现稳定性核素20Ne和22Ne（氖）。2、1929年，Naude发现了15N。3、1937年，Urey等首次报道人工生产15N的方法。4、1940年，先后获得具生物意义的15N、18O和3H大量生产。,5.1947年9月在美国Wisconsin大学召开了“同位素在生物学和医学中应用”专题讨论会，从此开始了稳定性核素示踪技术应用的新纪元。6.近20年，稳定性核素示踪技术迅速发展，分离分析方法取得了较大突破，13C、2H、18O、15N广泛应用于生物学、医学、环保、农药、农学、微生物等研究领域。我国先后分离了25种元素的100多种
2、稳定性核素，例如：15N标记化合物就有30余 种。,几个概念 稳定性同位素（Stable isotope）丰度（Abundance）A 即某核在该组同位素中浓度(通常指人工加浓了 的)。自然丰度（Natural abundaa）A自(AO)15N：0.365%、18O:0.204%原子百分超（Atom percent excess）a a=A-A自 又称富集度（Enrichment）富集15N（Enriched15N）贫化15N（Depeled15N),一.稳定性同位素示踪法的基本依据：1.自然界中一种元素同位素组成是相对恒定 2.同一元素的同位素具有相同的化学性质 3.同一元素的同位素之间存
3、在质量差异,重要化学元素的稳定性同位素元素 同位素 自然丰度 样品来源H 1H 99.985 新鲜的表面淡水 2 H(D)0.0147 B 10B 18.46 意大利天然硼酸盐 11B 81.54C 12C 98.892 捷克扑利兹石灰石 13C 1.108 N 14N 99.635 大气中的氮气 15N 0.365O 16O 99.759 大气中的氧气 17O 0.0374 18O 0.2039,氮的同位素表同位素 射线种类 半衰期 自然丰度12N+0.011S13N+9.96m14N-99.63515N-0.36516N-7.1S17N-4.15S18N-0.63S,稳定性同位素标记物的命
4、名 1978年国际纯化学和化学联合会IUPAC的命名法:结构式:15NHCl 或15NHCl（这样純的物质不存在)单标记化合物:H215N-CO-NH2 15N-尿素，例如15N的丰度可为5%，10%，15%双标记化合物(一个同位素):H215N-CO-15NH2尿素4.混合标记化合物:(15NH2)13CO(13C15N)尿素,核素 A（%）质量数 14N 99.635 14 15N 0.365 15注意：由于同位素之间的质量差异，因此它们的物理、化学、生物化学等性质会有所不同，进行实验时，需注意同位素效应。,二.稳定性同位素示踪法的特点：1.无放射性，无辐射效应及不良影响。2.安全、对人无
5、伤害。3.无污染，不受环境条件限制。4.无衰变，实验时间不受限制。5.可进行放射性示踪法难以进行的实验。例：N素中T最长的13N：T=9.096m,一 三.稳定性同位素分析法的基本流程 同位素引入生物体 动植物原始样品 仪器所需的待测样品,进样过程 质谱分析法 光谱分析法 记录 实验结果分析,四.影响15N引入丰度的因素 1.实验材料对15N的稀释程度。2.N素在不同部位分布的不均匀性 3.分析测定技术所能达到的精度。,15N示踪法引入N素肥料的丰度计算 参考公式 af=Wp Rp ap/Nf RN式中：af：N素肥料的原子百分超 Wp：植物总重量（待测）ap：植物样品中原子百分超 Rp：植物
6、样品中含N百分率,Nf：施纯N量 RN：N肥利用率,注意事项：1.同位素交换反应：在一定条件下，标记的铵盐可与大气发生反应：15NH+4水溶液+14NH314NH+4水溶液+15NH3 15N丰度高时应注意。2.同位素效应：藻类对14C、13C、12C的吸收依次递减。3.予测样品测定项目,五、质谱和光谱测定15N原理 14N和15质量不同质谱：把N2离子化为28N-N2，29N-N2，30N-N2 使其 在均匀磁场中发生不同角度偏转 2光谱：28N-N2：谱线波长为2976.8埃 29N-N2：谱线波长为2982.9埃 30N-N2：谱线波长为2988.6埃-,入口,出口,加速电压,1800的
7、均匀磁场,六.供仪器待测样品的制备、测量 1.对待测样品的要求：(1)因为测量的是不同质量离子流的相对含量，因此，保证有一定的N量即可。一般要求含N量1mg/ml最少不低于0.5mg。(2)仪器的本底检查。(3)离子峰的选择（14N和15N的峰比28N、29N小10倍，选28N、29N、30N）。(4)仪器精确度检查（检查去O2后的空气或纯N气）。,2.分析样品的制备：(1)K氏法（Kjeidali）质谱分析常用法。,A.样品的消化：（例：0.05g植样+10ml浓H2S04+3.3gSe:CuSO4:K2SO4为1:10:100混合催化剂样液清亮再消煮5h（土）或2h(植)，温度120-14
8、0。样品予处理：水杨酸硫酸法：5g干土或0.5g植样+12ml水杨酸：硫酸为50g：1000ml溶液中放置30min，再加2.5g硫代硫酸钠和15ml水，缓缓加热至停出起泡冷却常规消化）。,B.蒸馏：用蒸汽蒸馏将消化液中NH3分离出来，并测定总N。方法：消化液中加过量40%NaOH,释放的NH3被蒸汽逐出，经冷凝后被2%硼酸吸收，加入混合指示剂用标准硫酸滴定（设置一个标准液）。此步骤将NH3-N转变成了NH4+-N（铵态N），仪器分析适宜量1mgN/样品2-3ml(浓缩或稀释)。(制备好的样品送交仪器分析),以下在质谱仪上进行C.将NH4+-N转化为N2气:在真空条件下，将上述样品与次溴酸钠反
9、应，放出N气（在质谱仪内进行）详见书15N章节。,制样时注意：1.所有试剂纯度要高。2.消化要完全。3.防止样品间交叉污染（每个样品蒸馏前用蒸馏15ml乙醇洗器皿）。4.“Y”型管及内部反应抽气须彻底，防其它气体干扰。,以下在光谱仪上进行,可用液体样品也可用干样品(2).杜马法（Dumas）光谱分析中常用法适用于含N量低（少于100 g）的样品，光谱测量。,方法：A在放电管中装入样品，氧化剂（CuO）及吸收剂（CaO）抽真空，抽完后熔封放电管。在马福炉中燃烧0.5-3h（560）样品，（CaO吸收CO2和H2O)以产生N2气。B冷却至室温后在光谱仪上测定 纯样品火焰为粉红色或淡黄色 有CO2呈
10、白色，有水呈黄色）,注意：如果是液体样品。需用Pyrex玻璃管（1cm 2mm）吸满样液，烘干后再放入放电管。CuO、CaO使用前用700高温烘干除去CO2，H2O，并在12-18Kg/cm2压力下制成棒状,备光谱分析,仪器分析方法步骤：1、通电予热仪器10分钟，打开光电倍增管高压。2、放电管装入燃烧室固定架上。3、开高频发生器电源，使放电管中样品放电发光。4、选择适宜放大倍数对28N、29N、30N峰分别进行放大，在2970A0-2990A0之间扫描。5、放下记录笔，接通扫描开关，划出28N、29N、30N峰高。6、求得平均峰高，计算15N丰度。,七15N实验结果计算 14、15的质量比28
11、、29、30的小10倍，不参加运算 当15N丰度小于5%:R=质量为28离子流强度/质量为29离子流强度 此时30N的流子离强度很小，,1.丰度：A=1/2R+1100%(1),当15N丰度大于5%R=质量为29离子流强度/质量为30离子流强度 A=2/R+2 100%或者由质量为28、29、30的峰值直接算出：A=29+230/2（28+29+30)100%,以下以植物材料实验为例进行计算，其计算原理也适用于动物等，共同的条件是在一个相对封闭系统内开展实验。（若是用32P等实验，计算时把原子百分超换成比强度即可）2.植样的原子百分超:ap ap=A-A自（2）（A自=0.365%或空白实验值
12、）,3.植物从肥料中摄取N的%:Ndff 植物中N有多少%是来自于肥料（Percentage of in the plant derived from the fertilizer），可以是根、茎、叶、果实的任一Ndff Ndff=ap/af100%（设N素来源于土壤和肥料二方面）（3）af：肥料N的原子百分超（或动物饲料N的原子百分超，此时又多了一个动物排泄因素）。,上片解释见第五章第37片同位素稀释法,4、植物从土壤中摄取N的%（Percentage of in the plant tissue derived from the soil）:Ndfs Ndfs=1-Ndff(4)5、植物中
13、来自肥料的N量:Npf Npf=植物总N量ap/af（5）Npf+Nps=植物中总N量（已在定N中测定,K氏定N法）設总N来源于土壤和肥料，则：,6.植物中来自土壤N的量：Nps Nps=总N-Npf(6)7.N素利用率：R=Npf/Nf100%(7)Nf：施入纯N的总量 8.土壤A值：A值=Ndfs/NdffNf(Kg/公顷)（8）A值：表示土壤有效供应N素量(用A值可以解释为什么某种土壤适合于种植某种植物)。(来自：A值/Ndfs=Nf/Ndff),9、N素回收率：R回=已检出的Nf量/Nf100%(9)10、N素损失率：R失=100%-R回(10)以上公式适用32P等放射性物质（以比强为
14、单位）等计算。,练习题：蕃茄实验地中施用15N-尿素纯N20Kg/亩，收获后测得植物含N量为30Kg/亩，植物样品的15N丰度为0.67%，15N-尿素的15N丰度为1.37%，设自然丰度为0.37%，尿素的含N量为40%。求：1、每亩施入尿素量？2、肥料N素的利用率？3.A值?解：ap=0.67-0.37=0.3%af=1.37-0.37=1.0%Ndff=ap/af=0.3/1.0=30%Npf=NpNdff=30Kg/亩30%=9Kg/亩 施入尿素量：W=20/40%=80Kg/亩 肥料N素利用率：R=Npf/Nf=9/20=45%A值=Ndfs/NdffNf=70%/30%20Kg/亩
15、=46.7Kg/亩（土壤中可供蕃茄生长的每亩有效N-当然不是全部被吸收,A值愈大说明土壤的供N能力愈强）,下列研究方法：1.测根瘤数目和干物质产量。早、有无？2.氮素平衡法。十分烦琐。3.比较固N作物和非固N作物总N量差异。4.乙炔还原法。简单、灵敏。5.乙炔还原成乙烯，存在转换因子（3个）。,15N示踪与生物固氮(以下各方法简讲)工业固氮（Haber-Bosch反应）：N2+3H2 催化剂/45，200在气压 2NH3生物固氮：N2+6H+xATP 6e-/固氮酶 2NH3+xADP+xPi,6.同位素法：15N2还原法（Burris,1941）:充15N2密室进行 NdfA=a样/a气10
16、0%固氮量=NdfA总N量同位素稀释法（J、O、Legg等，1975），15N施入土壤 NdfA=1-a固/a非AN值法（M、Fried等，1975），田间种固N、非固N NdfA=(As+Afix-As)NdfF/Af As、Af、Afix分别代表土壤、肥料、大豆有效N量。NdfF:来自肥料N素的比例。,八、13C示踪法1样品的制备：（1）样品碳转化为BaCO3：干氧化法（Pregl）:如上图 湿氧化法（Weinhouse 1948）(2）BaCO3CO2转化：BaCO3+0.5%HCl:饱和NaCl(1:4)(真空、冷却),2测量：CO2在质谱中经电子轰击产生多种分子离子和原子离子。13C
17、%=1/R+1100%R=45/44其中：45示（13C16O16O）+和（12C16O17O）+，44示12C16O16O+（m/e）,（12C16O17O）+可用校正峰解决。,九.18O示踪法：样品制备：也是转化成CO2，很少用O2、N2O2、NO2。如：平衡法：H218O+C16O2=H216O+C18O2 碳酸盐与酸反应，直接放出C18O2。硅酸盐（2000真空炉）18O2和C反应成C18O2，1：1HgCl:Hg（CN）2氧化有机样品（Aubar等1955）测定：记录44（12C16O16O）+和4612C16O18O+离子流强度：18O%=1/2R+1100%R=44/46有时也取：R=32/34（O2样品）R=28/30（12C16O+）（12C18O）+,十.2H示踪法：样品制备：有机态HH2O1000锡丝H2或直接把H2O引入质谱（低丰度不宜）测定：记录3（HD）+和2（H2）+2H%=1/2R+1100%R=2/3,7,
