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1、第1章 组织学绪论,Introduction of Histology,一、组织学的研究内容和意义,组织学（histology）是研究机体微细结构及其相关功能的科学。只有学好组织学，认识人体的微细结构及其相关功能，才能全面掌握人体的形态结构，探索生命现象的物质基础。也只有认识了人体的正常结构，才能更好地分析和理解人体的生理过程和病理过程，才能学好生理学、病理学及其他医学基础课程和临床课程。,二、组织学发展简史,1显微镜的发明和细胞的发现；2显微镜的改进和细胞学说的确立；3组织概念的提出和组织学的建立诺贝尔奖；4现代组织学的发展。,三、组织学的研究方法和技术（一）普通光镜标本的制备和光镜观察,应
2、用普通光镜观察组织切片是组织学研究的主要技术，可获得有关组织细胞结构与功能的许多信息。光镜的放大作用由其光学部分实现，后者主要由聚光镜、物镜和目镜组成（图1-1）。生物组织和器官不能直接在光镜下观察，制备能使光线透过、微细结构清晰可辨的组织切片是组织学研究的基本方法，主要包括固定、切片、染色等步骤，常用石蜡切片、HE染色。,石蜡切片,组织块必须有一定的硬度方可切成薄片。首先用酒精和二甲苯将固定后的组织块脱水(dehydration)和透明(clearing)，再用熔化的石蜡浸透、包埋(embedding)，制成有一定硬度的组织蜡块，然后用切片机(microtome)将其切成510 m厚的组织切
3、片(tissue section)，贴于载玻片上(图1-2)。上述方法称石蜡切片(paraffin sectioning)，是组织学中的常规切片方法。,HE染色,组织学中最常用的染色方法是苏木精（hematoxylin）和伊红（eosin）染色法，简称HE染色法（HE staining）。苏木精使细胞核和细胞质中的核糖体等酸性物质染成紫蓝色，伊红使细胞质和细胞外基质中的碱性成分染成淡红色。与碱性染料亲和力强、易被染色的特性称嗜碱性（basophilia）；与酸性染料亲和力强、易被染色的特性称嗜酸性（acidophilia）；若与两种染料的亲和力都不强，则称中性（neutrophilia）。,（
4、二）激光共聚焦扫描显微镜,激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscope，CLSM)是一种高光敏度与高分辨率的生物学仪器，主要由激光光源、共聚焦成像扫描系统、光学系统和计算机图像分析系统4部分组成。CLSM光源产生激光束，并通过入射针孔的光阑作用入射到样品各点上。另外，在发射光检测光路上有一个检测针孔，检测针孔和入射针孔的位置相对于物镜的焦平面是共轭的，即所谓“共聚焦”。经样品反射的光通过透镜成像，被探测器接收，再经过光电信号转换在显示屏上；图像同时被传送到计算机图像分析系统，进行二维或三维的分析处理（图1-3）。,（三）电子显微镜术,电镜（Elec
5、tron Microscopy）不同于光镜之处是用电子束代替可见光，用电磁场代替玻璃透镜。电镜又分为透射电镜术和扫描电镜术。,各种显微镜的分辨率与人眼的比较,l透射电镜术,透射电镜术（Transmission electron microscopy）用电子束穿透标本，经过电磁透镜的会聚、放大后，在荧光屏上成像，直接观察，或将影像投射到照相底片，制成电镜照片进行观察。透射电镜的分辨率可达0.10.2 nm，放大倍数从几千倍到几十万倍。由于电子束穿透力弱，电镜标本需制成5080 nm的超薄切片。,2扫描电镜术,扫描电镜术（Scanning electron microscopy）用于观察细胞、组织
6、和器官表面的立体微细结构。将小块组织（直径约0.3 cm）经固定和临界点脱水干燥后，在其表面喷镀薄层碳膜和金属膜。扫描电镜发射的细电子束在样品表面按顺序逐点移动扫描，使样品表面金属膜发射出电子（称二次电子），二次电子信号被探测器收集，经过放大，在荧光屏上成像。扫描电镜的景深长，图像清晰，富有立体感。,（四）组织化学和细胞化学技术,组织化学（histochemistry）和细胞化学（cytochemistry）技术是应用化学反应原理检测组织和细胞的化学成分并进行定位和定量的技术。组织细胞中的糖类、脂类、蛋白质、核酸、酶等均可与相应试剂反应，最后形成有色反应终产物或电子致密物，应用光镜或电镜进行观
7、察。糖类物质常用过碘酸-Schiff反应(PAS反应)显示（图1-4）。脂类常用苏丹染料、油红O、尼罗蓝等脂溶性染料染色。,（五）免疫组织化学,免疫组织化学是根据免疫学原理，应用带有可见标记的特异性抗原-抗体反应，检测组织、细胞中多肽和蛋白质等大分子物质的一种技术。进行免疫组织化学染色时，首先要获得被检多肽或蛋白质等大分子物质的抗体。其次，要对抗体进行标记。常用的标记物有荧光染料，如异硫氰酸荧光素(FITC)、得克萨斯红(Texas red)；酶类，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等；重金属，如胶体金、铁蛋白等。最后，应用标记抗体孵育标本，标记抗体即与组织细胞中的相应抗原发生特异性结合，可分别在荧
8、光显微镜、普通光镜和电镜下观察。,免疫细胞化学的方法,免疫细胞化学技术主要有直接法和间接法（图1-5）。直接法是标记某抗原的特异性抗体（又称第一抗体），用标记的第一抗体孵育标本以检测其中的抗原成分。在间接法中，第一抗体不标记；以第一抗体作为抗原免疫另一动物，制备抗第一抗体的抗体，即第二抗体，并标记第二抗体。染色时，先后以第一抗体和标记的第二抗体处理标本，在抗原存在部位形成抗原-第一抗体-标记第二抗体复合物，以达到检测该抗原的目的（图1-6）。为了在一张组织切片上同时显示两种抗原物质，以发现其定位、形态、甚至功能上的相互关系，可使用免疫细胞化学双重染色（double staining）（图1-7
9、）。电镜免疫细胞化学常用胶体金标记技术（图1-8）。,（六）原位杂交,原位杂交是一种在组织细胞原位进行的核酸分子杂交技术，敏感度高，特异性强，是当前分子生物学研究的重要手段。原位杂交的原理是两条单核苷酸链通过碱基互补原则紧密结合，形成稳定的杂交体。根据这一原理，用一条碱基序列已知、经特定标记的核苷酸链为探针，与组织切片、细胞制备或染色体标本中的待检DNA或mRNA片段进行杂交，然后显示标记物，从而获得待检核酸的分布和含量等信息(图1-9)。按照探针分子的性质，可将其分为cDNA探针、cRNA探针和寡核苷酸探针。,（七）放射自显影术,放射自显影术(Autoradiography)可通过研究机体对
10、放射性核素标记物的摄取和代谢过程来检测机体、细胞和组织的生物学特性及功能状况。,（八）活体组织和活细胞研究方法,1组织（细胞）培养术将组织或细胞放置在体外适当的条件下培养的技术统称组织培养术。利用机械分散法或酶（如胰酶和胶原酶等）消化法分离组织中某种细胞，使其成为单细胞悬液，然后接种于培养瓶或培养板，使之贴壁生长或悬浮生长，称为细胞培养（图1-10）。细胞培养一般在二氧化碳培养箱中进行，严防微生物污染，同时要有合适的温度、O2和CO2浓度、湿度等。培养细胞的营养来自培养基，可根据培养细胞的种类选用不同的培养基。,2.组织工程,组织工程是用细胞培养术在体外模拟构建组织或器官的技术，它是生物医学和
11、材料科学交叉融合的产物，也是目前生物医学研究的热点。国内、外学者应用组织工程技术已开展了许多人造组织和器官的研制，如皮肤、软骨、骨、肌腱、角膜、神经、血管、气管等，其中组织工程化皮肤和软骨已获得成功，并用于临床（图1-11）。组织工程的基本方法是：取少量组织，分离、培养细胞（称种子细胞）；应用人工合成的有机高分子聚合物（如聚羟基乙酸和聚乳酸）或天然的细胞外基质成分（如胶原和纤维蛋白）制备有一定形状和空间结构的三维支架；将种子细胞种植到支架上，在体外培养或植入体内；细胞生长增殖，并分泌细胞外基质，而支架材料逐渐降解吸收，从而形成有一定结构和功能的组织或器官，用于组织修复。,3活体染色与活细胞染色
12、,活体染色与活细胞染色（Vital Staining and Vital Cell Staining）活体染色是将无毒的染料注入动物体内，组织或细胞选择性摄取染料后，通过显微镜观察，研究其分布和功能等。如将墨汁注入动物体内，被巨噬细胞吞噬，从而观察巨噬细胞的分布和吞噬活性。也可对分离的活细胞或体外培养的细胞直接进行染色，称体外活体染色。如取血液，与煌焦油蓝染液混合，染色数分钟后涂片镜检，可显示网织红细胞并进行计数，以判断骨髓的造血功能。,4.活细胞与死细胞的鉴别,有些染料不能进入活细胞，但可进入细胞膜通透性发生改变的死细胞。如活细胞对台盼蓝拒染，而死细胞被染成蓝色，常用此方法检测培养细胞的存活
13、率。Hoechst 33258和碘化丙啶是常用的荧光染料，均可与DNA结合。Hoechst 33258可进入活细胞和凋亡细胞，使细胞核呈蓝色荧光，活细胞的荧光均匀，凋亡细胞的荧光不均匀、增强或边聚。碘化丙啶只能进入死细胞，使其核呈红色荧光。因此，用这两种染料进行体外活体染色，可区别活细胞、凋亡细胞和坏死细胞（图1-12）。,（九）形态学研究的定量术,1形态计量术形态计量术（Morphometry）是运用数学和统计学原理对组织和细胞进行二维和三维形态学测量的一种研究技术，如细胞及其微细结构的数量、表面积、体积、周长等的相对值和绝对值。其中三维立体结构的研究又称体视学。传统的体视学方法是将测试系统
14、（点、线、网格等）投影或覆盖在切片或照片上，进行测点计数、交点计数、轮廓计数、粒子计数或长度测量等测试，根据平面测量的数据按一定的数学公式推算出其立体数值。,2流式细胞术,流式细胞术（Flow Cytometry）是近年建立的细胞定量和分类技术，可对细胞进行生物化学和生物物理特性的快速定量测定。流式细胞仪由液流系统、激发光器件、信号检测系统和控制系统、细胞分选系统等组成。其工作原理是分离被检细胞，制成单细胞悬液，并进行荧光染色或标记，然后使单细胞液流快速通过该仪器的激光照射分析区，被检细胞产生不同的荧光信号转变为电脉冲，分别输入计算机内贮存，并显示于示波器屏幕上，即可获得该细胞群体中不同类型细
15、胞的有关数据。流式细胞术广泛应用于细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学等的研究。,（十）示踪术,示踪术是用细胞标记技术追踪细胞运动轨迹、细胞分化途径和细胞来源的一种研究方法，是胚胎学研究中的常用技术方法，如对神经嵴细胞的迁移和分化研究。常用尼罗蓝、中性红、辣根过氧化物酶、放射性同位素等作为示踪标记物。这些示踪剂应用方便、标记明确、易于观察，但会随细胞的分裂增殖而逐渐衰减和消失，因而不能长期追踪。近年来，人们将含有某一报告基因的逆转录病毒导入某种细胞，该基因的表达产物变成了这种细胞的示踪标记。这种自然标记和转基因标记不会随细胞增殖而衰减，可长期示踪。,Thank you,显微镜下的药物胶囊,图1-
16、1 光学显微镜模式图,示光镜的主要构成成分和光路,图1-2 石蜡包埋标本切片机,图1-3 激光共聚焦扫描显微镜成像原理示意图,图1-4 PAS反应示肝细胞内的糖原颗粒（箭头）苏木精复染 高倍,图1-5 免疫细胞化学基本原理示意图,图1-6 免疫细胞化学ABC法染色示大鼠腺垂体黄体生成素阳性细胞 高倍,图1-7 荧光免疫细胞化学双重染色 高倍,大鼠中脑含酪氨酸羟化酶（TH）的神经元被FITC标记，胞质呈绿色（粗箭头）；含钙结合蛋白D28K（CB）的神经元被得克萨斯红标记，胞质和胞核呈红色（细箭头）；TH和CB都含的神经元胞质呈黄色，胞核呈红色（双箭头）,图1-8 电镜免疫细胞化学染色（胶体金标记第二抗体法）,箭头示狒狒下丘脑酪氨酸羟化酶阳性轴突内的胶体金颗粒,图1-9 原位杂交光镜像 高倍,A35S标记前列腺特异抗原（PSA）cDNA探针，放射自显影显示人前列腺上皮内PSA mRNA的表达，苏木精复染B地高辛精标记蛋白激酶C（PKC）1寡核苷酸探针，免疫细胞化学显示大鼠海马锥体细胞内PKC1 mRNA的表达,图1-10 培养的大鼠骨髓间充质干细胞 高倍,图1-11 人耳形组织工程软骨,图1-12 培养的人白血病HL-60细胞 Hoechst 33258和碘化丙啶染色 高倍,A活细胞B凋亡细胞C坏死细胞,
