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1、地球每年陆生植物可产纤维素约51011吨(5000亿吨),我国每年秸秆6-7亿吨 合成速率相当于全人类每人每天70千克 是地球上最丰富的再生资源,约占地球生物总量的60%。80纤维素未被开发利用,纤维素的利用前景诱人，但难度不小。,纤维素生物质,纤维素的显微结构,纤维素酶 组成成份及其特征,纤维素酶是生物炼制中的一种重要关键酶。是水解纤维素-1，4-葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，它不是单一酶，而是起协同作用的多组分酶系。酸性纤维素酶是一种具有310个或更多个组分构成的多组分酶。依其作用可分为:-1，4-内切葡聚糖酶（Endo-Glucanase，简称EG,Cx）,主要
2、作用于无定形纤维素,水解产生纤维糊精,纤维寡糖.-1,4-外切葡聚糖（纤维二糖水解）酶（Cellobiohydrolase，CBH,C1）,主要作用于结晶纤维素,产生纤维二糖.-葡萄糖苷酶（-Glucosidase，G）,水解纤维二糖为葡萄糖。,纤维素酶分子是由球状的催化结构域（Catalytic domains,CD）通过一个富含脯氨酸或羟基氨基酸的连接桥（Linker）和纤维素结合结构域（Cellulose binding domains,CBD）三部分组成。连接桥的作用可能是保持CD和CBD之间的距离。,纤维素酶对纤维素的作用机理,天然纤维素酶解过程可分三个阶段：,首先是纤维素对纤维素酶
3、的可及性 其次是纤维素酶的被吸附与扩散过程 最后是由EG、CBH和G自组织复合体协同作用降解纤维素的结晶区，同时由EG、CBH和G随机作用纤维素的无定形区。,理论一,理论二,外切酶C1酶作用于不溶性的固体表面,疏松纤维素结晶结构并起水化作用，使形成结晶结构的纤维素链开裂，长链分子的末端部分游离，从而使纤维素链易于水化。内切酶Cx酶随机水解非结晶纤维素、可溶性纤维素衍生物和纤维寡糖、纤维糊精，-葡萄糖苷酶将纤维二糖和纤维三糖水解成葡萄糖。,结晶纤维素,C1,无定形纤维素,纤维二糖,G,葡萄糖,Cx,应用,纺织棉布后整理、生物抛光,饲料工业饲料酶、秸秆青贮,啤酒工业,食品及发酵工业果汁加工、功能性
4、成分提取中草药成分提取,酒精发酵 玉米酒精红薯酒精秸秆酒精,纤维素酶水洗牛仔裤,秸秆酒精流程,影响纤维乙醇产业化的主要因素,（1）木质纤维素预处理技术有待进一步优化和提高。由于天然纤维素原料的结构复杂的特性，使得其纤维素、半纤维素和木质素三者不能有效分离；另外伴随产生一些中间副产物，实验表明，这些物质抑制酵母的生长和代谢，最终影响乙醇产率。（2）缺乏高效的纤维酶菌株，现有的纤维素酶制剂水解效果较低，使得酶解糖化经济成本较高，当前生产一吨纤维乙醇需要酶制剂成本在22002600元。（3）缺乏能够同时高效利用戊糖和己糖的发酵菌株。在木质纤维水解中，其中有相当比重的木糖（葡萄糖/木糖约为2：1）。因
5、此，戊糖的利用是影响纤维乙醇综合成本的关键一项。,产纤维素酶的主要微生物,纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、软体动物、原生动物、细菌、放线菌和真菌等都能产生纤维素酶。其中微生物主要的有：霉菌类：康氏木霉(Trichoderma koningii)绿色木霉（Trichoderma viride)里氏木霉（Trichoderma reesei）腐殖菌（Humicola insolens）黑曲霉(Aspergillus niger)斜卧青霉(Penicillium decumbens)、解纤维顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)等。,产纤维素酶细菌,有粪肥纤维单胞菌(Cellul
6、omonas fimi)，高温单胞菌属,高温单胞菌(Thermomonospora.fusca)梭菌属,如丁酸梭菌(Clostridium butyricum)芽孢杆菌(Bacillus sp.)等。尤其是一些厌氧菌，如梭状芽孢杆菌(C.thermocellum)和拟杆菌(B.cellulosolvens)，分泌的纤维素酶具有很高的比活力，但是它们不能产生高酶效价。此外栖息于草食动物的消化道、特别是反刍动物的瘤胃中的厌氧性细菌,可产生纤维素酶,对纤维素进行分解，如产琥珀酸拟杆菌、牛黄瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌等。,不同来源微生物纤维素酶的性质比较,纤维素分解菌的筛选方法,纤维素刚果
7、红培养基法：纤维素能同刚果红染料形成红色，而纤维素酶的水解产物纤维糊精、纤维二糖和葡萄糖不能同刚果红染料形成红色沉淀，为浅黄色，所以在纤维素刚果红培养基上，凡能形成浅黄色水解圈的菌落即是能产纤维素酶的菌株，还可以根据水解圈的大小（产酶能力强水解圈大），估计菌株产酶的情况，筛选高产菌株。,磷酸膨化纤维素平板筛选法：纤维素用85%磷酸膨化后，破坏了纤维素的结晶结构，使纤维素结构蓬松，易于被纤维素酶水解。在磷酸膨胀纤维素(Walseth)培养基上，用稀释法或划线法分离出能使磷酸膨胀纤维素降解形成水解透明圈的菌落，挑选形成透明圈大的菌落，筛选产纤维素酶的优良菌株。此外，还有滤纸片、球磨纤维素底物培养基
8、筛选鉴别方法。,绿色木霉生长在膨化纤维素平板上形成产酶透明圈,纤维素酶酶活表示方法,1、滤纸酶活（FPA，FPase）以滤纸为酶反应底物，该酶活反映综合酶活力，更主要反映外切酶活2、羧甲基纤维素钠酶（CMCase)以CMC为酶反应底物，主要测定内切酶活性3、Avicelase 酶活以微晶纤维素Avicel为酶反应底物，主要测定外切酶活性 4、-葡萄糖苷酶以水扬素为底物测定；以PNPG（对-硝基苯-D-葡糖苷）为底物测定。纤维素被纤维素酶水解所产生的还原糖一般用DNS试剂检测。,纤维素酶活力的定义,在pH4.8，50 条件下测定,酶活单位定义为水解底物每分钟产生1mol葡萄糖（或产物）为1个活力
9、单位。,Avicelase 酶活的测定,（以Avicel为酶反应底物，主要测定外切酶活性）Avicel为微晶纤维素，由于Avicel本身有少量还原糖干扰测定，所以需用去离子水洗涤Avicel 2-3次，去除还原糖，洗涤烘干后的Avicel作为酶活测定的底物。称取50mg Avicel，放入20毫升试管底部，加入2ml pH4.8 0.1M Hac-NaAc 缓冲液，放入50水浴中预热2-3min，加入适当稀释酶液0.5ml，立即计时，50振荡反应1h，加入3ml DNS溶液终止反应，沸水浴煮5min，冷却至室温后，加入10ml去离子水，摇匀后，4000-5000rpm离心5min,上清夜用72
10、1分光光度计于535nm波长下，测定吸光度。以去离子水代替酶液，同上操作，为参比（OD=0）。,羧甲基纤维素钠酶活（CMCase）的测定,（以CMC为酶反应底物，主要测定内切酶活性）取适当稀释的酶液0.5ml于20ml试管中，放入50水浴中预热2-3，加入2 ml 1%CMC溶液（用pH4.8 0.1M Hac-NaAc缓冲液配制），立即计时，50反应30min后，加入3ml DNS溶液终止反应，沸水浴煮5min，冷却至室温后，加入10ml去离子水，摇匀后，用721分光光度计于535nm波长下，测定吸光度。以去离子水代替酶液，同上操作，为参比（OD=0）,-葡萄糖苷酶（也称纤维二糖水解酶）,（
11、1）以水扬素为底物测定 取适当稀释的酶液0.5ml于20ml试管中，放入50水浴中预热2-3min，加入2 ml 1%水杨素溶液（用pH4.8 0.1M Hac-NaAc缓冲液配制），立即计时，50反应30min后，加入3ml DNS溶液终止反应，沸水浴煮5min，冷却至室温后，加入10ml去离子水，摇匀后，用721分光光度计于535nm波长下，测定吸光度。以去离子水代替酶液，同上操作，为参比（OD=0）,-葡萄糖苷酶（也称纤维二糖水解酶）,（2）以PNPG（对-硝基苯-D-葡糖苷）为底物测定取适当稀释的酶液0.1ml于10ml试管中，放入50水浴中预热2-3min，加入0.9 ml 0.1%
12、PNPG溶液（用pH4.8 0.1M Hac-NaAc缓冲液配制），立即计时，50反应30min后，加入1ml 2%Na2CO3溶液终止反应，摇匀后，用721分光光度计测定对-硝基苯在410nm波长下的吸光度。以去离子水代替酶液，同上操作，为参比（OD=0）,纤维素酶高产菌株,70-80年代国外主要采用诱变育种方法获得筛选高产菌，包括随机诱变和有目标诱变，其主要策略是：1、解除分解代谢阻遏，解除葡萄糖、甘油等易分解代谢碳源对产酶阻遏，或筛选2-deoxyglucose抗性。2、提高酶的胞外分泌性，如筛选对细胞壁合成抑制作用的化学物质抗性菌株3、筛选-葡萄糖苷酶高产菌株，设计-glucosida
13、se作用的有色底物，获得解除分解代谢阻遏高产突变株。,代表性菌株高产菌株,国外代表性菌株有Trichoderma reesei QM9414,Rut C-30,MCG-77,MCG-80,CL-287,41GKDR-11,KDG-12,KDD-10等。,国内菌种诱变选育情况,王家林等对康氏木霉NT-15进行紫外线、电磁波辐射、线性加速器，亚硝基胍等物理、化学的诱变方法，获得了高产菌株NT15-H,固体培养滤纸活力为3670u/g,Cx酶活力1800U/g，此菌种在工厂化生产中性能稳定。,张苓花等采用康氏木霉W-925经过硫酸二乙酯和紫外线复合诱变，筛选得到产酶活性高的菌种Wu-932，该菌种C
14、MC糖化力达到2975 u/g，滤纸糖酶活性为531U/g，比出发菌W-925分别提高了100%和81%。化工部饲料添加剂技术服务中心采用里氏木霉A3进行紫外线和亚硝基胍复合诱变后，将处理过的孢子接种于纤维双层平板上，30培养5-8天，15放置7-10天，挑选透明圈直径和菌落直径比较大的单菌落进行三角瓶固态发酵再筛选，得到了产纤维素酶活力很高的里氏木霉91-3菌株。,中科院微生物研究所董志扬等用康宁木霉通过射线照射和亚硝基胍交替处理，诱变出一株纤维素酶高产菌株T801，其产酶能力提高1.77倍。青岛海洋大学管斌等对里氏木霉进行低剂量、反复多次紫外线、亚硝基胍复合诱变处理方法，用“以2-脱氧葡萄
15、糖作为降解产物阻遏物”高效筛选方法，选育得到一株抗分解代谢阻遏的突变株，纤维素酶活力提高三倍。,纤维素酶基因工程菌构建,20世纪80年代以后一直至今，以纤维素酶过量生产为主要目的，构建高产纤维素酶基因工程菌的研究十分活跃。目前里氏木霉(T reesei)纤维素酶中的内切酶：EGI、EGIII和EGV基因外切酶：CBH I,CBH II，-葡萄糖苷酶：GI，GII等纤维素酶中各组分蛋白分子量，氨基酸残基组成，基因长度与序列均已被调查清楚。,纤维素酶基因工程菌构建策略,由于纤维素酶是一个多酶体系，要得到一个有实际应用价值的纤维素酶，大多采用产纤维素酶菌种Trichoderma reesei为外源基
16、因的表达宿主，采用基因工程手段改造里氏木霉，提高产酶活力。1、通过扩增内切酶或外切酶蛋白基因的拷贝数，2、外源-葡萄糖苷基因转入到里氏木霉 3、引入高比活的外源内切酶或外切酶基因，强化内切酶或外切酶的活性，可获得改变纤维素酶系组成和高活性的纤维素酶工程菌。,如1、国内某公司利用采用厌氧真菌Orpinomyces的高比活（220U/mg）内切纤维素酶基因CelB，转入到里氏木霉中，筛选高产菌株，发酵CMCase酶活达到400-1200 IU/ml。2、诺维信公司把米曲霉的-葡萄糖苷基因转入到里氏木霉 Rut C-30，得到高-葡萄糖苷酶活性表达量的里氏木霉SMA135-04，该纤维素酶有利于对纤
17、维素的水解。,浙江大学化工与生物工程系，采用里氏木霉Trichoderma reesei ZU-02，提取木糖后的玉米芯残渣为碳源，最适底物浓度为研究了40 g/l，最适C/N 比为8.0，500 ml三角瓶摇瓶发酵 7天，纤维素酶活力为5.25 IU/ml(213.4 IU/g cellulose)，放大到30吨搅拌发酵罐，4天发酵，酶活达到5.48 IU/ml(222.8 IU/g cellulase)。10%(w/v)玉米芯残渣，用20 IU/g 底物加酶量,，水解率达到90.4%,江南大学利用里氏木霉Trichoderma reesei 高产突变株WX12，以纤维素粉、麸皮和豆粕为原料
18、，30发酵，CMCase 达到600IU/ml，滤纸酶活FPase达到17 IU/ml。河南天冠企业集团采用里氏木霉R3 液体深层发酵，发酵过程采取分段控制pH 值、温度和溶氧的工艺,发酵120 h 酶活力最高,FPA 和CMC 酶活力分别达到48.9IU/ml 和321.68IU/ml。,美国能源部、国家再生能源实验室（NREL）总投资超过3000万元美元，与和杰能科GENENCOR、诺维信NOVOZYMES公司合作研发的生物基乙醇燃料项目中降低纤维素酶成本,提高酶活已取得了可喜的成果，采用生物信息、直接进化等生物技术，将生产1加仑燃料级酒精所需纤维素酶的成本从最初超过5美元的水平降至仅需要
19、耗费约10-18美分（实验室条件下），降低了约30倍的成本。欧洲和美国最大酒精制造商之一Abengoa Bioenergy公司已于2006年在位于美国内布拉斯加州的生物废料分馏处理中试基地对诺维信酶制剂工艺进行测试。一旦实现该项目的商业化操作，将有助于减少对不可再生、基于石油的能源和原材料资源的依赖。,1、液体发酵：机械搅拌罐发酵（分批发酵，流加发酵）气升式罐发酵优点：液体发酵原料利用率高、生产条件易控制、产量高、工人劳动强度小、产品质量稳定、品质高，容易大规模生产。缺点：设备投资大、要求高；发酵动力消耗大。2、固体发酵：固体发酵反应器有转鼓式、圆盘式、浅盘式等。一般来说固体发酵产酶活力是液体
20、发酵酶活力的几十到几百倍。如采用周期脉冲技术，可改善传质、传热，提高产酶活力。优点：设备投资相对较小、发酵动力消耗小，酶活高，产量高。缺点：不容易大规模生产，产品品质不高，劳动强度较高；,纤维素酶的发酵生产方法,气升式液体发酵 转鼓式固体发酵,纤维素酶的研究发展趋向,构建纤维素酶高产基因工程菌，或现有生产菌种通过基因工程技术改造。纤维素酶的蛋白质工程，纤维素酶的人工进化，创造比活性更高、酶水解温度高，水解效率更强的纤维素酶。,表1、国产、国外液体纤维素酶产品活力比较,不同纤维素水解制糖过程其参数比较稀酸、浓酸、酶解、氢氟酸,浓酸水解纤维素/半纤维素为混合糖过程技术,蒸汽,蒸汽,木质素,过滤,过
21、滤,1级水解,2级水解,浓硫酸,酸再浓缩,酸/糖 溶液,生物质,纯化的糖溶液,石灰,离心,混合罐,石膏肥料,混合糖到发酵或直接转化加氢 热转化,色谱分离,酸回收,固体,水,回收冷凝物,蒸汽,强硫酸,固体,固体,泵,液体,A 10-StepOverview,10,6,7,5,4,3,2,1,8,9,纤维素乙醇前景,随着对纤维素酶研究的不断深入，以及生物化学、分子生物学、生物信息学、结构生物学以及基因工程等多种交叉学科的快速发展，获得适合工业生产的高比活力、低成本的纤维素酶将不再是可望而不可及。此外采用浓酸化学法水解植物纤维素也取得了很大进展和突破。纤维素水解制糖技术在不远的将来会成为现实，纤维素
22、乙醇将变得有竞争力，其前景乐观。,木聚糖酶(Xylanse),木聚糖,木聚糖(-l，4-xylan)是植物半纤维素的主要成分。它是自然界中含量仅次于纤维素的多糖，分别占被子植物和裸子植物干质量的 1530和712。木聚糖是吡喃木糖以-l，4-糖苷键连成主链的不均一多糖，侧链通常有O-乙酰基，-L-呋喃阿拉伯糖基，葡糖醛酸基。,木聚糖结构,木聚糖酶,木聚糖酶是一类木聚糖降解酶系，主要是由1，4D木聚糖内切酶和1,4D木糖苷酶(外切酶）组成，此外还有一些脱支链酶，如L呋喃型阿拉伯糖苷酶、葡萄糖醛酸苷酶，乙酰木聚糖酯酶及能降解木聚糖上阿拉伯糖侧链残基与酚酸形成的酯键酚酸酯酶等。,木聚糖酶作用,木聚糖
23、酶活的测定,以燕麦或桦木木聚糖为酶作用的底物，采用DNS测酶水解所释放的还原糖（木糖），酶活单位定义为在一定pH值、一定温度下，每分钟水解木聚糖释放1微摩尔木糖的酶量为1个活力单位(U)。,木聚糖酶的生产,可由不同菌属的微生物产生 1、芽孢杆菌属（Bacillus）木聚糖酶 2、曲霉属（Aspergillus）木聚糖酶3、木霉属（Trichoderma）木聚糖酶4、链霉菌属（Streptomyces）木聚糖酶5、不同嗜热菌的木聚糖酶,1、芽孢杆菌属（Bacillus）木聚糖酶,2、曲霉属（Aspergillus）木聚糖酶,3、木霉属（Trichoderma）木聚糖酶,4、链霉菌属（Strept
24、omyces）木聚糖酶,5、不同嗜热菌的木聚糖酶,木聚糖酶的应用,医药,能源,食品,纺织,饲料,制浆造纸,应用,木聚糖酶在制浆造纸工业上的应用,在制浆造纸工业中，传统的化学漂白方法是采用多步骤的氯、二氧化氯漂白及碱提取来去掉木质素，在废水中含有大量的氮及有毒的、强烈致癌致畸物质，造成严重的环境污染。木聚糖酶用于纸浆漂白是用木聚糖酶来降解木素碳水化合物的复合体，可减少漂白纸浆的化学药品用量，提高后续漂段的漂白效果的目的。经过木聚糖酶处理，在相同的其他漂白条件下可使漂浆白度提高26IS0，并能简化漂白废水的处理程序，降低污染。1986年科学家发现用木聚糖酶处理纸浆，可降低漂白时氯的用量。1991年
25、芬兰最早开始在造纸中商品化应用木聚糖酶。,在饲料中的应用,1、木聚糖酶在饲料中的作用机理 谷物籽实中都会含有一定量的抗营养因子非淀粉多糖(NSP)，NSP分为可溶性NSP(SNSP)和不可溶性NSP(INSP)，影响动物对养分消化率的NSP主要是SNSP。小麦、麦麸、米糠中的SNSP主要是木聚糖。酶制剂能消除NSP的抗营养作用，主要是NSP酶将NSP降解为小分子，从而改变NSP的抗营养特性。木聚糖酶是专一降解木聚糖的复合酶，主要是由-l，4-D-内切木聚糖酶和-l，4-D-外切木糖甘酶组成，此外，还有一些脱支链酶。木聚糖酶破坏木聚糖分子中的共价交联(阿拉伯糖残基取代区)及通过氢键形成的连接区(
26、主链上的非取代区)，使木聚糖的水溶性及粘性大大下降，从而降低对肠道的负作用。,木聚糖酶在动物中的作用,降低胃肠道食糜的粘性。能够提高内源性消化酶的活性，促进养分的消化吸收。破坏细胞壁结构。减少肠道微生物数量，有利用猪的健康木聚糖酶添加到日粮中能提高猪对高纤维饲料的利用率，改善健康状况，缓解饲料资源短决的情况，并可提高生长猪淀粉、粗蛋白质及灰分的回肠消化率，但不影响各营养指标的粪表现消化率。,培烤用酶，可提高面筋网络的弹性，增强面团稳定性，改善加工性能，改进面包瓤的结构，增大面包体积，改善面包品质。纺织中棉麻织物整理酶解木聚糖生产低聚木糖（双歧杆菌增殖因子）,木质素降解酶,木质素是植物中仅次于纤
27、维素的最丰富和最重要的有机高聚物。由一系列的苯丙烷单元通过醚键和碳碳键连接的复杂无定形的、光化学惰性、交联且具有高度分散性的芳香多聚物，高度抗生物降解。它和半纤维素、果胶一起作为细胞间质填充在细胞壁的微细纤维之间。通过自由基木质素的化学结构复杂，许多植物的木质素结构仍未完全清楚。木质素主要是通过氧化还原酶催化苯氧自由基，通过自由基反应完成木质素的降解。,木质素降解酶,在已知的木质素降解微生物中，白腐菌（Phanerochaete chrysosporium）研究的较多，该菌可产生木质素过氧化物酶LiPs、锰过氧化物酶MnPs、漆酶，是一种多酶复合体，氧化还原酶是木质素降解酶的主体。,木质素过氧
28、化物酶(EC 1.11.1.13Lignin Peroxidase,简称LiP),LiP能催化芳香基化合物的降解LiP 是一种含血红素的糖蛋白,血红素埋在蛋白质内构成活性中心。LiP 受到H2O2 的触发而发生氧化成为酶中间体LiP，LiP与芳环底物反应,通过从芳环上取得电子，导致其形成阳离子自由基,进而发生断裂反应。LiP 能氧化高氧化还原电位的化合物,主要是非酚类的芳香族化合物(包括非酚类的木质素模式化合物和芳烃类污染物)、合成木质素及氰化物等其他化学物质。,LiP首先从木质素或木质素模型化合物中产生一个电子，形成阳离子基团，进而导致裂解反应，引起丙基侧链Ca-C 链断裂，后者再经历一系列
29、非酶反应产生各种终产物。,锰过氧化物酶(EC 1.11.1.14 Manganese Peroxidase，简称MnP),MnP 也是一种糖蛋白,酶活性中心是由一个血红素基和一个Mn2+构成,还有两个起稳定结构作用的Ca2+。MnP 表现出对Mn2+的绝对需要,MnP 先催化Mn2+转为Mn3+,Mn3+再去氧化大量的酚类底物。MnP既可氧化酚型结构也可氧化非酚型结构，其能将Mn(II)氧化成Mn(III)，而Mn(III)是氧化剂，可在离MnP活性位点一段距离的地方起作用，但不能氧化非苯酚结构，只能通过C芳基开裂和其他降解反应氧化木质素中约占10%的抗性更强的酚结构。MnP氧化氧化还原电位相对低的化合物,包括酚类木质素模式化合物的各种单酚和双酚,所以MnP 被视为是一种酚氧化酶。除了酚类化合物,MnP 还能氧化胺类、染料,在纸浆、染料的脱色中起主要作用。,漆酶EC 1.10.3.2(Laccase,简称Lac),Lac 是一种含铜的多酚氧化酶,和植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白同属蓝色多铜氧化酶家族。Lac 能催化各种芳烃类化合物(特别是酚类)的氧化,在这一过程中,Lac 从酚类化合物的羟基中除去单电子,形成苯氧自由基,并伴随着1 分子氧发生4 电子还原,生成2 分子的水,
