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1、第五章 育种出发菌的分离筛选,2023/8/23,2,向菌种保藏机构索取有关的菌株。,菌种来源的途径,国内外著名的菌种保藏机构有：CCCCM(中国微生物保藏管理委员会）ATCC(美国典型菌种保藏中心）NCTC(英国国家典型菌种保藏所)IFO(大阪发酵研究所),2.从一些发酵制品中分离目的菌株。容易筛选到较理想的菌株。3.由自然界采集样品中获得。如土壤、水、动植物 体等，从中进行分离筛选。容易发现新的菌株资源。,2023/8/23,3,菌株分离与筛选,菌株分离(separation)：是将样品中混杂生长的各种微生物通过分离技术区分开，获得所需微生物的过程。菌株筛选(screening)：在目的菌
2、株分离的基础上，结合常规生产性能测定，选择目的产物合成能力相对高的菌株的过程。,2023/8/23,4,菌株分离和筛选,2023/8/23,5,第一节 含微生物样品的采集第二节 含微生物样品的富集培养第三节 微生物的分离第四节 野生菌株筛选和目的产物鉴定,主要内容,2023/8/23,6,第一节 含微生物样品的采集,2023/8/23,7,含微生物样品的采集,一、从土壤中采样,1 根据土壤特点采集,土壤有机质含量和通气状况,2023/8/23,8,典型的土壤层次结构,A soil profile,2023/8/23,9,不同土壤类型,2023/8/23,10,地理条件 南方土壤比北方土壤中的微
3、生物数量和种类都要多。,季节条件 秋季是采样的良好季节,土壤的酸碱度,2023/8/23,11,2 土壤中采样的方法,选点,取土,装袋,标记,用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5-25cm处的土样10-25g，,记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件,2023/8/23,12,二、根据微生物生理特点采样,根据微生物营养类型,微生物的营养需要和代谢类型与其生长环境有着很大的相关性。,在筛选一些具有特殊性能的微生物时，需根据该微生物独特的生理特性到相应的地点采样。,根据微生物的生理特性,2023/8/23,13,局部环境条件。如：海洋、肠道、温泉、堆肥,极端环境条件。在绝大多数微生
4、物所不能生长的高温、低温、高酸、高碱、高盐或高辐射强度的环境下，也有少数微生物存在，这类微生物被称为极端环境微生物。,三、特殊环境下采样,2023/8/23,14,第二节 含微生物样品的富集培养,2023/8/23,15,富集(enrichment)培养：是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，并创造有利的生长条件，使目的微生物在合适的环境下迅速生长繁殖，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要菌株的过程。富集培养主要根据微生物的碳源、氮源、pH、温度、需氧情况等生理因素加以控制。,2023/8/23,16,一、控制培养基的营养成分,二、控
5、制培养条件 通过对pH、温度及通气量等其他一些条件的特殊要求加以控制培养，达到有效的分离目的。如 pH 细菌、放线菌：一般要求偏碱(pH7.2-7.5)，霉菌和酵母菌：要求偏酸(pH4.5-6)。,2023/8/23,17,三、抑制不需要的菌类,通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量，使目的微生物的比例增加，达到富集的目的。如：硫乙醇酸钠造成厌氧环境，利于厌氧菌生长。抗生素可抑制细菌生长，用于培养霉菌。,2023/8/23,18,2023/8/23,19,第三节 微生物的分离,2023/8/23,20,一、好气微生物的分离,分离的方法很多，可分为“菌落纯”和“菌株纯”。,1 稀
6、释涂布法,2023/8/23,21,2 划线分离法,2023/8/23,22,3 利用生化反应进行分离,2023/8/23,23,变色圈法：,2023/8/23,24,透明圈法,2023/8/23,25,脂酶产生菌的分离：可采用固体平板变色圈法。甘油三丁酸脂为底物，罗丹明 B 为指示剂，观察荧光圈；制备维多利亚蓝乳脂琼脂培养基(pH 7.0)，将样品涂布在平板上培养，阳性反应由粉红色变为蓝色。改良双层法：平皿底层倒一层营养琼脂，把一片浸有被维多利亚蓝染色的乳脂的圆纸片铺在上面，然后覆盖一薄层含样品营养琼脂，保温培养，阳性反应为蓝色。,2023/8/23,26,4 组织分离法,是从一些罹病组织或
7、特殊组织中分离菌株的方法。,对一般患病组织的分离方法,取样,无菌水洗涤,表面消毒,无菌水洗涤表面,植入平板，培养,镜检，分离纯化,2023/8/23,27,食用菌孢子分离法,a.多孢子分离法 孢子采集装置,2023/8/23,28,NT-88NE 显微操作系统：(NARISHIGE)适用于各种用途：转基因、遗传工程、人工受精、胚胎移植、和电生理学方面。,b.单孢子分离法,2023/8/23,29,5 特殊菌类环保菌的分离,在分离某类污染物或废弃物的降解微生物时，通常采用以该物质为唯一碳源或氮源的培养基进行富集培养，经过几个月的富集培养后，通过划线或涂布的方法进行在分离平板上分离、筛选。该法在分
8、离苯胺、DDT、甲基对硫磷（MP）、石油、甲胺磷等污染物降解菌时取得良好效果。,注意：环境污染物一般对微生物的生长有抑制作用，需要根据不同情况设计合理的筛选模型。,2023/8/23,30,二、厌气菌的分离,加还原剂,焦性没食子酸法,平皿厌气培养法,试管厌气培养法,玻璃板隔绝空气培养法,生物吸氧法,2023/8/23,31,厌氧培养袋,厌氧培养罐,厌氧工作站,厌氧操作仪器,2023/8/23,32,第四节 野生菌株筛选和目的产物鉴定,2023/8/23,33,一、初筛,定义：从大量分离到的微生物中将能合成目的产物的微生物筛选出来的过程。筛选的方法有以下两种：,1 平板筛选,用于在分离纯化阶段随
9、机挑选的菌株，用选择性平板进行定性测定。特点：快速，简捷，效率高。,2023/8/23,34,2 摇瓶发酵筛选,用于经过定性筛选的菌种，通过摇瓶发酵进一步测定菌株相互之间产物活性的差异。特点：比较接近发酵罐培养条件。,2023/8/23,35,二、复筛,将初筛得到的菌株进行发酵罐发酵，然后精确分析（如：电泳、色谱、质谱等精密仪器）测定其确切的产量水平，从而确定用于生产的菌株的过程。,复筛的工作：优化培养基成分；注意各种培养条件对菌体量或产物量的影响，并对各种影响因子进行组合实验，初步掌握该菌的适合培养条件。,三、筛选结果评价,2023/8/23,36,Thanks for your attention,2023/8/23,37,思考题,1、菌株分离和筛选的一般过程是什么？2、利用生化反应进行菌株分离的主要方法有哪些？,
