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1、肿瘤基因治疗的基本策略和常用方法,一.肿瘤和基因治疗的基本概念二.采用基因治疗肿瘤的基本策略三.常采用的基因治疗方法四.对未来肿瘤基因治疗的展望 The maker:,一.肿瘤和基因治疗的基本概念,1.肿瘤（Tumor）机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的异常病变。学界一般将肿瘤分为良性和恶性两大类。,2.基因治疗 指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说，基因治疗还可包
2、括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。,3.什么是肿瘤基因治疗 基因治疗的经典概念指通过外源基因导人人体以纠正内在的基因缺陷的疗法。肿瘤基因治疗不再局限于“纠正基因缺陷”，系指将外源的正常基因导人人体，达到直接或间接抑制或杀伤肿瘤细胞的目的。基因是生命之本，是生物得以保持其连续性和稳定性的物质基础。随着对恶性肿瘤发生发展分子机制研究的不断深人，出于对肿瘤是一种基因病的认识，加之恶性肿瘤的发病率和病死率较高，这使得恶性肿瘤的基因治疗成为近年来基因治疗研究的主要内容和热点。,4.与基因治疗有关几个概念 a.基因毒癌发生发展的第一步是活化致癌物，改变细胞内的DNA，导致原癌基因的移位及扩增
3、，这些特殊基因的翻译，使带有这些异常基因细胞的某些特性得以专一表达，一个特殊的化学物对一系列细胞有诱变及DNA修复作用者，称为基因毒。目前人类已知的致癌物均为基因毒。b.原癌基因(前癌基因)细胞癌基因存在于细胞基因组内，激活前的细胞癌基因称为原癌基因(前癌基因)，一旦原癌基因激活成癌基因便会引起细胞癌变，癌基因激活后，通过其表达产物改变细胞生长和分化规律，诱发细胞癌变。细胞癌基因被激活的途径很多，如启动子插人，基因重排和扩增，基因点突变和DNA分子中去甲基化等。,c.抑癌基因正常细胞中存在抑制肿瘤发生的基因，称为抑癌基因。抑癌基因的存在从最初的一个发现中得到证实，即一个肿瘤细胞和一个正常细胞融
4、合成的杂交细胞，往往不具有细胞表型，即使两种不同的肿瘤细胞杂交，也可能是非肿瘤性的，只有正常的亲代失去某些基因之后，其子代才会发生肿瘤。后来，通过限制性内切酶片段长度多态分析及分子克隆技术的研究证实，正常细胞中有一类对细胞增殖起负性调节作用的基因，如大肠癌中的p53基因，视网膜母细胞瘤和骨肉瘤中的Rb基因。这两种基因也是目前被确认并研究最为深人的抑癌基因。如将正常的Rb基因转人骨肉瘤细胞，Rb基因表达增高，细胞分裂几乎完全抑制，将Rb基因转人前列腺细胞，对正常细胞的生长无影响，但抑制了细胞的癌变，所 以当这一类的抑癌基因发生丢失，失活或变异时，就会促进细胞恶变。,二.采用基因治疗肿瘤的基本策略
5、,目前国内外恶性肿瘤基因治疗基本策略包括：1.免疫性基因治疗 2.病因性基因治疗 3.溶瘤腺病毒基因治疗 4.自杀基因治疗等,1.免疫性基因治疗,a.免疫性基因治疗的对象:在肿瘤发生发展过程中，免疫系统发育未完善（3-4岁）和免疫机能衰退（老年人的细胞免疫和体液免疫功能均衰退）而出现两个肿瘤发生的年龄高峰期。胸腺发育不良（Digeoges）综合症或咽囊综合症是因胸腺发育不良而导致细胞免疫系统停留在未分化阶段，这类患儿兼有细胞免疫缺陷和体液免疫缺陷的共济失调，恶性肿瘤的发生率高达10%。由此说明细胞免疫和体液免疫功能的正常或活性增强在抗恶性肿瘤的发生中是不可缺少的。,选择性IgA缺乏：患者血浆中
6、IgA极低，而IgG、IgM与细胞免疫正常，组织中缺乏分泌IgA的浆细胞，约10%发生胃癌。当IgM缺乏时，约有8%患者发生恶性肿瘤以及淋巴网状恶性疾病。研究发现当患者免疫球蛋白很低，抗体产生受到严重影响时，临床上病人除了反复发生化脓性感染外，其患者发生恶性肿瘤率为8-10%，常见类型为淋巴网状系统肿瘤（56%）和胃肠道上皮癌（26%）。Wiskott-Aldrich综合症：（严重混合型免疫缺陷综合症）以血小板减少出血，反复感染为临床特征，早期细胞免疫完善，随之淋巴细胞减少，体外淋转反应缺乏，病儿很少活过青春期，约8-10%发生淋巴网状系统肿瘤。,1.2 免疫性基因治疗的方法 研究发现在肿瘤发
7、生发展过程中存在着机体免疫系统对肿瘤细胞的免疫耐受状态，而这种状态可能源于肿瘤细胞本身的免疫性不强（如MHC表达不足），也可源于抗原递全细胞（APC）不能提供足够的共刺激信号（如B7）或者机体免疫因子分泌不足，在免疫性基因治疗中通过以下三种方法纠正机体免疫的耐受状态。,a.将某些细胞因子（如IL-2、TNF-a等）的基因转染到机体免疫细胞（如TIL、LAK细胞及细胞毒淋巴细胞）中，大幅度提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和反应能力。使用细胞因子的基因治疗在一定程度上克服了细胞因子注射疗法需反复多次应用，副作用严重等缺点，疗效有较大幅度提高。可以这样认为：肿瘤免疫细胞因子基因治疗的开展，为恶性肿瘤
8、患者带来生的希望，其疗效的稳定，治疗的简单、安全，已成为肿瘤免疫基因治疗研究的最常用方法而独树一帜，前景是令业内人士振奋的。,b.肿瘤细胞存在功能性MHCI类抗原和共刺激信号表达不足，将一些与免疫识别有关的基因（如HLA、B7等）转染到体外培养的肿瘤细胞，经照射后再植入肿瘤患者体内;或者表达HLA-B7的病毒载体或质粒DNA与脂质复合物直接注射到瘤体内，以大幅度增强肿瘤细胞对机体免疫系统的免疫原性，诱导宿主的免疫反应而提高宿主的免疫监视功能和对肿瘤细胞的攻击能力，达到治愈率的提高具有积极作用。,c.制备肿瘤KNA疫苗 采用编码特异抗原的基因直接注入人体，通过其在机体内的表达从而激发机体对编码抗
9、原的免疫反应。应用癌胚抗原（CEA）制备的DNA疫苗在实验中显示出一定效果，研究的前景可观，进入临床药理实验只是时间问题而毋庸置疑。,2 恶性肿瘤的病因性基因治疗,肿瘤病因性基因治疗主要针对癌基因和抑癌基因，其治疗策略是抑制、阻断癌基因的表达或替代，恢复抑癌基因的功能。从而达到治疗肿瘤的目的。,a.针对癌基因治疗采用反义寡核苷酸、核酸、三链结构寡核苷酸（Triplex-forming oligonucleotides，TFO）抑制肿瘤细胞的基因转录，抑制癌基因的表达将有可能使肿瘤的基因表达调控回复到正常并使细胞重新分化或者诱发其凋亡（Apoptosis）。由于转条是遗传信息放大的过程，因此对癌
10、基因的表达抑制来说更为有效，其治疗前景是极为乐观的。,b.针对抑癌基因治疗替代或恢复由于缺失或突变而丢失的抑癌基因（Tumor suppressor gene）的正常功能是肿瘤病因性治疗的手段而被世人所公认。利用抑癌基因治疗肿瘤，在体外的实验和实验治疗学中取得较好的疗效；但在体内由于肿瘤体积较大；内环境又十分复杂，基因转移率限制等因素的干扰，抑癌基因治疗的确切疗效不尽人意值得进一步研究。,3 溶瘤腺病毒基因治疗,a.溶瘤腺病毒的特点：具有复制性，因此所需病毒颗粒较小；能扩展至邻迈肿瘤细胞，作用范围广泛；溶瘤腺病毒可产生溶瘤和抗肿瘤免疫反应；溶瘤腺病毒由于能够复制故存在着不安全因素（转移、扩散、
11、活化）对肿瘤患者造成损害而失去可控性应引起注意和警惕。,b.溶瘤腺病毒的主要分类：利用肿瘤特异表达的调控序例的表达：黑色素瘤表达酪氨酸酶，肝细胞癌表达甲胎蛋白（AFP），结直肠癌表达癌胚抗原（CEF）从而控制病毒复制。利用肿瘤细胞生物学特性，如腺病毒复制时抵抗宿主细胞凋亡可能相关的EIB55K蛋白发生变异或缺失时，病毒复制的宿主细胞就会发生凋亡，从而使复制不能完成。代表为E1B55K剔除的d11520（onyx-015）腺病毒，它能够在抑癌基因P53缺陷的肿瘤细胞中复制，从而达到裂鲜肿瘤细胞，同时又不损伤正常细胞的目的其特异的选择性十分明显。值得期待的是D11520和TH101病毒已进入III
12、期临床试验。这时于癌症的预防的作用将产生深远的影响。,4 自杀基因治疗,一些来自病毒或细菌的基因具有一些特殊的功能，其表达产物可将原先对哺乳动物细胞无毒的或毒性极低的前药（Prodrug）转换成毒性产物，导致这些细胞的凋亡。这类基因即称为“自杀基因”（Suicide gene）由于自杀基因表达的产物多是能够将前药代谢为毒性产物的酶，故又称为“前药转换酶基因”或“药物敏感基因”。根据细胞自杀机制，将自杀基因作为治疗性目的基因应用于肿瘤治疗的研究称为肿瘤的自杀基因方式。在临床实践中设计肿瘤细胞特异性自杀机制的基因治疗方案对肿瘤治疗具有重大的实际应用价值。,a.自杀基因疗法中酶和前药,b.自杀基因的
13、特异性控制 要高效及特异性表达肿瘤自杀基因对肿瘤细胞的作用，自杀基因必须局现于肿瘤细胞以选择性杀伤肿瘤细胞。一是利用免疫脂质体，受体介导法进行定向基因转移或直接瘤内注射。二是利用肿瘤细胞生物学特性，通过逆转录病毒介导HSV-TK基因（I型单纯疱疹病毒胸腺激酶）选择性治疗脑肿瘤。三是利用肿瘤特异表达的调控序例，如酪氨酸酶、甲胳蛋白（AFP）和癌胚抗原（CEA），在自杀基因的上游安插特异的转条调节序例，可以实现自杀基因的特异表达，从而克服传统化学治疗药物作选择性问题和较为严重的细胞毒问题，使肿瘤治疗有较大幅度的进展。,c.旁观者效应（Bystander effect）用外源性自杀基因转染肿瘤细胞后
14、，未能转染的肿瘤细胞可因邻近的少数肿瘤细胞携带有自杀基因而被前体药物杀伤。研究发现，旁观者效应产生与自杀基因的种类、肿瘤细胞的类型及数量有关。TK/GCV系统的旁观者效应是比较明显和突出的。,三.常采用的基因治疗方法,a.基因修饰肿瘤细胞“疫苗”疗法 将某些细胞因子基因如IL-2、IL-4、TNF-、INF-、GM-CSF等转染肿瘤细胞，可使肿瘤细胞表达活性细胞因子。转染细胞因子基因的肿瘤细胞基体内致瘤性丧失，耐动物预接肿这种转基因肿瘤细胞后，该动物对再接种的同种肿瘤有抵抗作用。能分泌细胞因子的转基因肿瘤细胞具有肿瘤疫苗作用，成为新型的肿瘤“疫苗”。这种肿瘤疫苗的作用机制是由于细胞因子表达后，
15、一方面促进肿瘤表达特异抗原并诱发宿 主抗肿瘤细胞毒性淋巴细胞(CTL)反应;另一方面分泌的细胞因子增强CTL和其他抗癌效应细胞的作用。,b.基因修饰TIL的过继免疫疗法 将细胞因子导入TIL细胞中，活化后的TIL具有显著抗自身肿瘤的作用，回输体仙后有聚集于肿瘤部位的倾向，携带的抗癌免疫增强性细胞因子基因在肿瘤局部表达量增加，同时还避免全身大剂量投用IL-2、TNF-等细胞因子所引起的严重毒副反应。目前已将TNF-基因导入TIL，并在癌症患者中进行临床试验。,c.免疫增强基因疗法 是将MHC1类抗原基因经体内导入肿瘤细胞内，增加其免疫原性，有效地激活机体抗癌免疫反应，降低肿瘤细胞的致瘤性。d.原
16、位修饰肿瘤免疫原性的基因疗法 直接在体内原位修饰肿瘤免疫原性，诱导肿瘤特异性细胞毒反应，同时肿瘤组织的CTL可产生一种“旁观者效应”(bystander effect),即CTL不仅可以杀伤转导基因阳性肿瘤细胞，还可以杀伤转导基因阴性肿瘤细胞，使受基因治疗的瘤灶消退时，其他未治疗的瘤灶也会消退。,e.癌基因拮抗疗法 肿瘤的发生与癌基因的激活和抑癌基因的失活有关，可以通地阻断癌基因的表达或恢复抑癌基因的功能来抑制肿瘤的发展或恢复其正常表型。,四.对未来肿瘤基因治疗的展望,目前，在基因导入载体方面出现了两 大主流：一是非病毒载体系统；二是病毒载体系统。a.非病毒载体主要包括改性的天然高分子和合成高
17、分子两大类。由于非病毒系统导入基因的效率相对较差，故在基因治疗临床试验中的使用率不到20%；但非病毒载体的生物安全性较好，特别是靶向性的脂质体、靶向性 的多聚物，以及脂质体/多聚物/DNA 复合物等新产品的出现，结合电脉冲、超声等新技术，明显提高了导入效率和靶向性，是今后非病毒载体发展的重要方向。,病毒载体在基因治疗领域的应用最为广泛，大约70%的治疗方案采用了病毒载体，包括各种逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒等。这些 病毒载体有各自的特点，同时也存在各自的局限性。此外，还必须深入研究逆转录病毒诱发癌症的机理，构建更为安全的载体。基于同源重组和基因定点纠错原理，在DNA 水平的原位修复(靶向性)是遗传性疾病基因治疗的理想措施。与基因治疗载体系统相比，治疗基因表达调控的研究和进展相对滞后，主要受制于载体的包装容量。随着人类基因组计划的进展与完成，新的基因座控制区、隔离子、内含子、特异的启动子、增强子等的发现与分离，必定带动基因治疗向前发展。,
