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1、肿瘤基因治疗的新进展,广州市第一人民医院泌尿外科钟惟德,随着人类对自身认识的不断深化,从人体解剖学开始,已经进入了细胞和分子病理生理学研究,特别是从基因水平上阐明人类遗传与疾病这一核心本质。中国科学院院士吴祖泽,当前人类基因组研究已经从结构遗传学进入了功能遗传学研究,它将对疾病的诊断,预防与治疗产生深远的影响。,自20世纪中期起，分子生物学理论与技术飞速发展Watson等（1953年）发现DNA双螺旋结构60年代遗传密码被破译70年代建立DNA重组和测序技术以及癌基因与抑癌基因研究的突破80年代基因治疗的研究和逆转录病毒载体的开发，为基因诊断和治疗提供了理论依据与技术方法。,基因治疗是指将外源
2、基因或核酸导入人体防治疾病的一种新技术和新的治疗方法。出于对肿瘤是一种基因病的认识，加之恶性肿瘤发病率、死亡率较高，这使得肿瘤基因治疗的研究成为近20年来基因治疗的主要研究内容和热点。,基因治疗确切地说，它指的是遗传信息相关的特异性DNA序列的转移，是一项高度集成、综合性高难度的生物技术。基因治疗是最初是以治疗单基因遗传病为主，而现已广泛应用于包括泌尿系肿瘤等疾病的治疗研究。,肿瘤基因治疗的实施主要包括以下三个方面：寻找具有治疗意义的目的基因；建立有效的向靶细胞转移目的基因的载体系统；使目的基因在靶细胞中表达，发挥生物学效应，达到治疗目的。,基因治疗的原理和方法,肿瘤基因治疗的原理是将目的基因
3、用基因转移技术导入靶细胞，使期表达此基因而获得 得特定的功能，继而执行或介导对肿瘤的杀伤和抑制作用，从而达到治疗之目的。基因治疗涉及目的基因、载体及受体细胞三方面。,有效的基因治疗依赖于外源基因高效而稳定的表达。利用病毒载体介导基因转移，以其高转染率和良好的靶向性而成为肿瘤基因治疗中应用最广泛的方法，其中包括逆转录病毒、腺病毒（AV）、腺相关病毒（AAV）、单纯疱疹病毒（HSV）、痘苗病毒（VV）等载体。,目前常用的基因治疗方法，可以归纳为以下两种体外法（ex vivo）体内法（in vivo）,一种方法是体细胞基因治疗或称“二步基因治疗”，即将受体细胞在体外培养转移入外源基因，经过适当的选择
4、系统，把重组的受体细胞回输患者体内，让外源基因表达以改善患者症状。这种方法是目前基因治疗普遍采用的方法，又称为体外法（ex vivo）。,另一种方法称为“直接法基因治疗”，提指不需要细胞移植而直接将外源DNA注射至机体内，DNA可以单纯注射，也可以与辅助物如脂质体一起注射，使其在体内转录、表达而发挥治疗作用，故又称为体内法（in vivo）。,体内法的基因治疗方式比体外法简单、直接、经济，疗效也比较确切，常有的体内基因直接转移手段有病毒介导、寡核苷酸直接注射、受体介导、脂质体介导和体内基因直接注射等。此外尚有原位法（in situ）。,TARGETING ANDROGEN RECEPTOR I
5、N HORMONE-INDEPENDENT CANCER:GROWTH INHIBITION AND INDUCTION OF APOPTOSIS THROUGH DOWN REGULATION OF THE ANDROGEN RECEPTOR WITH SMALL INTERFERENCE RNA.Petra Haag,Iris E Eder,Innsbruck,Austria,干扰RNA 对非雄激素肿瘤靶细胞生长抑制与诱导细胞刁亡的规律,基因治疗策略,体外法基因治疗需要从患者体内取出细胞，并以治疗基因修饰，回输表达治疗基因的修饰细胞于患者；体内法基因治疗是直接注射含治疗基因的载体于患者,基
6、因治疗应有两个基本目的：一是恢复异常表达或缺失的体细胞基因的功能；另一个是引入有治疗价值的其他来源的基因。,第一个目的包含的内容较广泛，如恢复肿瘤局部的抗肿瘤免疫功能，阻止异常表达的癌基因，恢复肿瘤抑制基因功能，恢复细胞周期调节基因和恢复机体对肿瘤转移的抑制等。第二个目的包括引入前药转换基因，却除或转移多药耐药基因等。,因此，肿瘤的基因治疗除了干扰肿瘤细胞的生长规律，纠正其恶性表型外，尚恢复和加强肿瘤局部微环境和全身濒痪的抗肿瘤系统的功能。针对以上目的，基因治疗目前主要集中在免疫基因治疗、肿瘤抑制基因治疗和药物敏感基因治疗等方面。,研究中的主要基因治疗途径,包括1.转导编码前药活化酶基因进入肿
7、瘤细胞（HSV-TK）2.将野生型p53基因引入肿瘤细胞，使正常 造血干细胞表达药物抵抗蛋白（MDR）3.转导细胞因子基因进入宿主细胞（IL-X）4.制备表达免疫制激分子（GM-CSF）的肿 瘤细胞疫苗,免疫基因治疗 将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫。,基因修饰肿瘤细胞“疫苗”疗法 将某些细胞因子基因如IL-2、IL-4、TNF-、INF-、GM-CSF等转染肿瘤细胞，可使肿瘤细胞表达活性细胞因子。转染细胞因子基因的肿瘤细胞基体内致瘤性丧失，耐动物预接肿这种转基因肿瘤细胞后，该动物对再接种的同种肿瘤有抵抗作用。,能分泌细胞因子的转基因肿瘤细胞具有肿瘤
8、疫苗作用，成为新型的肿瘤“疫苗”。这种肿瘤疫苗的作用机制是由于细胞因子表达后，一方面促进肿瘤表达特异抗原并诱发宿 主抗肿瘤细胞毒性淋巴细胞（CTL）反应；另一方面分泌的细胞因子增强CTL和其他抗癌效应细胞的作用。,美国达纳法贝尔癌症研究所的科学家通过基因工程的方法，使膀胱癌细胞表达一种叫做GMCSF（颗粒细胞集落刺激因子）的细胞因子，研究人员将癌细胞处理后再将其注射给膀胱癌病人。结果发现，70病人的肿瘤里出现了浸润的免疫细胞，说明免疫系统已经对肿瘤发起了攻击。,基因修饰TIL的过继免疫疗法 将细胞因子导入TIL细胞中，活化后的TIL具有显著抗自身肿瘤的作用，回输体内后有聚集于肿瘤部位的倾向，携
9、带的抗癌免疫增强性细胞因子基因在肿瘤局部表达量增加，同时还避免全身大剂量投用IL-2、TNF-等细胞因子所引起的严重毒副反应。目前已将TNF-基因导入TIL，并在癌症患者中进行临床试验。,免疫增强基因疗法 是将MHC1类抗原基因经体内导入肿瘤细胞内，增加其免疫原性，有效地激活机体抗癌免疫反应，降低肿瘤细胞的致瘤性。,原位修饰肿瘤免疫原性的基因疗法 直接在体内原位修饰肿瘤免疫原性，诱导肿瘤特异性细胞毒反应，同时肿瘤组织的CTL可产生一种“旁观者效应”（bystander effect）,即CTL不仅可以杀伤转导基因阳性肿瘤细胞，还可以杀伤转导基因阴性肿瘤细胞，使受基因治疗的瘤灶消退时，其他未治疗
10、的瘤灶也会消退。,免疫基基治疗是很有前途的一种治疗途径。因为它可以用体外方式，从而避免目前缺乏体内有效导入系统的局限性；同时，由于它可调动机体的免疫反应，因此具有“旁观者效应”。建立瘤苗库和利用原递呈细胞系统等也是有希望的治疗途径。,癌基因拮抗疗法 肿瘤的发生与癌基因的激活和抑癌基因的失活有关，可以通地阻断癌基因的表达或恢复抑癌基因的功能来抑制肿瘤的发展或恢复其正常表型。,阻断癌基因的功能 将反义癌基因导入癌细胞中、癌基因缺失突变、引入非等位基因rev等方法阻断癌基因功能。,反义癌基因实际上是人工合成的与与癌基因mRNA互补的寡核苷酸，即反义寡核苷酸（ODNs）。反义核酸在转录和翻译水平阻断某
11、些异常的基因的表达，以阻断癌细胞内的异常信号传导，使癌细胞进入正常分化轨道或引起细胞凋亡。,用基因替代等方法恢复和增强肿瘤抑制基因的功能 如将克隆的抑癌基因Rb、p53、p16等导入肿瘤细胞，可以逆转其恶性行为，诱导细胞“凋亡”。这类研究已从实验研究过液压到临床试验阶段，其中对p53基因的部分临床试验结果显示了其潜力。,Roth等直接在瘤体内注射携公平野生型p53基因的重组腺病毒（Adp53）治疗膀胱鳞癌和非小细胞肺癌，结果绝大多数肿瘤组织可表达p53基因，肿瘤体积缩小，瘤体坏死和调亡等。由英国、法国和意大利组织的国际临床合作小组直接将野生型p53基因表达质粒注射放肾癌瘤体内，未见明显毒副反应
12、，8例患者中有1例完全缓解达19个月，3例肿瘤体明显缩小，此外还有报道称，将细胞周期抑制基因p21wafl导入p53缺失的肿瘤，效果比转导野生型p53更好。,自杀基因疗法一些来自病毒或细菌的基因具有某些特殊的功有，其表达产物可将原先对哺乳动物经细胞增毒或极低毒性的药物转换成毒性产物，导致这些细胞死亡。将这类基因转入靶细胞，使之对某些药物具有特别的功能，可以利用这些药物使靶细胞“自杀”。,常见的“自杀基因”包括胸苷激酶基因（tk基因）和胞嘧啶脱氨酶基因（CD基因）等。将这些基因导入某一细胞，通过基因重组织这些基本获得内源性表达，生长特定的酶类，这些酶可以使无素毒或低毒性前药转换成毒性产物，阻断核
13、代谢途径，使表达这些基因的细胞对某此传真物具有特别的敏感性，最终导致这些细胞死亡。,极有意义的是，此类基因更可以通过“旁观者效应”杀伤未导入基因的邻近分裂细胞，扩大其杀伤效应。如将单线纯疹病毒胞苷激酶基本（HSV-TK）导入肿瘤细胞，从而干扰肿瘤细胞DNA合成，导致肿瘤细胞死亡，正常细胞则不被伤害。,基因修饰配合大剂量化疗 癌症患者的癌细胞中存在着能耐受多种化疗药物的高活性多药耐药基因（MDR1），这些患者往往抵抗多种化疗药的治疗。用反义RNA或DNA灭活MDR1是提高该类患者化疗效果的有效途径。,抗肿瘤血管形成基因治疗：,考虑到血管形成在肿瘤发生中的重要作用，抗血管形成的治疗成为非常有潜力的
14、控制肿瘤生长的治疗方法。,抗血管生成基因治疗的研究主要包括：（1）针对血管形成生长因子及其受体的基因治疗；（2）血管形成抑制因子基因治疗；（3）针对肿瘤血管内皮细胞的自杀基因治疗等。这些方法通过特异作用于瘤床的微血管内皮细胞而控制肿瘤生长，虽然目前抗血管形成基因治疗尚未进入临床，但可以相信其会有较广泛的临床应用前景。,基因治疗存在的关键问题,基因导入的载体系统问题 目前所采用的载体主要分为两大类，即转染性和转导性载体。转染性载体是利用化学或物理方法增加细胞膜的通透性而将DNA转染入细胞内，这种方法包括脂质体和基因枪等。转导性载体则是利用病毒对细胞的天然亲和力把遗传物质引入宿主细胞。,转染的方法
15、相对简易行，抗原性弱但效率较低，而且基因表达的持久性不够。因此它在肿瘤基因治疗中的使用受到限制，也难以取得理想效果。转导法则高效、持久，但抗原性较强，目前大多数基因治疗程序仍以病毒介导。,近年来，国外学者力求通过新型靶向性载体及包装细胞的设计来克服其缺陷。在靶向型载体方面，包括：（1）采用带有组织特异性内部启动子，如甲胎蛋白启动子、癌胚抗原（CEA）启动子及酪到激酶启动子等构建靶向型逆转录病毒辣载体；（2）利用反式激活因子调节LTR启动子；,3）利用特异分子桥，这种分子桥既可与病毒颗粒相结合，也可与特异性的细胞表面受体结合的，指导病毒粒相结合，也可与特异性的细胞表面受体结合的，指导病毒感染特异
16、的靶细胞。,带有目的基因的载体如何到达“靶细胞”是肿瘤基因治疗的关键。只有提高基因转导的靶向性，才能实现治疗的针对性和安全性，目前国际上解决基因的靶向转移及表达有三种策略：,基因治疗的“靶细胞”或“靶组织”选择问题,第一种方法是以基因工程手段改造基因载体，如改造逆转录病毒包装细胞中的原病毒序列，使所包装的重组病毒特异地识别位于靶细胞表面的抗原或受体决定簇；,第二种方法是在体内基因传递系统中共价连接抗瘤抗体和肿瘤细胞特异受体的配基，使基因在类似“生物导弹”作用下被送到肿瘤细胞表面,第三种方法是应用肿瘤细胞特异蛋白“管家基因”的基因表面调控元件，在转录水平调控目的基因在靶细胞中特异表达。此外，肿瘤新生血管的内皮细胞也是一个很好的“靶”细胞及组织，国外已开始针对VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2设计反义基因或调控VEGF的基因作为目的基因，可能是一个有前景的思路。,展望,目前肿瘤基因治疗的研究大多是在观察毒副反应为主的期临床试验，少数进入/期临床试验，结果有待进一步观察。有人认为虽然目前的临床研究进程过慢，但动物实验的结果并不能完全代表人类，而临床试验具有决定性的作用。,基因治疗可能会在手术、放疗和化疗以外，成为一种新的肿瘤治疗手段，特别可能对提高化疗、放疗的敏感性，减少肿瘤复发和转移等方面有一定的、甚至更为重要的作用，成为肿瘤综合治疗中的一个较为重要的组成部分。,谢谢,
