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1、肿瘤标志物的实验诊断及其进展,肿瘤现况：,根据WHO资料，全球范围内恶性肿瘤是人类仅次于心脑血管病的第二大死亡原因，占总死亡人数的22%，并逐年增加。10种常见肿瘤：胃癌、肝癌、食管癌、结直肠肛门癌、白血病、子宫颈癌、鼻咽癌、乳腺癌和膀胱癌。,肿瘤标志物(tumormarkers，TM),1978年Herberman在美国国立癌症研究所召开的人类肿瘤免疫诊断会上提出的。由肿瘤组织和细胞产生的与肿瘤的形成、发生相关的物质,这些物质存在于肿瘤细胞的胞核、胞质、胞膜上或体液中；不存在于正常成人组织而见于胚胎组织,或在肿瘤组织中含量超过正常含量。存在于肿瘤患者的组织、体液和排泄物中，能够用免疫学、生物
2、学及化学的方法检测。,理想的TM：,特异性高，对肿瘤与非肿瘤鉴别的准确性可达100%。敏感性高，能在极早期发现肿瘤的存在，不漏诊。在体液中的浓度应与瘤体大小、临床分期密切相关，并可据此判断预后。半衰期短，可根据其水平的升降监测治疗效果及肿瘤是否复发或转移。检测方法灵敏可靠，操作简便，价格低廉。,肿瘤标志物的测定：,肿瘤细胞特异或相关抗原的测定肿瘤相关酶含量活性的测定肿瘤相关激素水平及其受体数量的测定细胞刺激因子的测定癌胚基因产物、癌基因及其癌基因蛋白、抗癌基因等测定,肿瘤标志物的用途:,肿瘤的筛选肿瘤的早期诊断肿瘤治疗后随访、疗效监测肿瘤复发的监测、预后判断利用肿瘤细胞表面标志选择性进行单克隆
3、抗体治疗,一 肿瘤标志物的分类,TM的分布广，分类和命名尚未统一，一般可按蛋白质、酶、糖脂和糖蛋白类、多胺、激素类和基因等进行分类。,1 肿瘤相关性抗原及蛋白类：,甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、糖类抗原（CA50、CA199、CA125、CA242、CA153、CA724）、血清铁蛋白(SF)、组织多肽抗原(TPA)、血清2微球蛋白(2-MG)、前列腺特异抗原(PSA)、游离前列腺特异抗原(F-PSA)、尿本斯-琼斯蛋白(B-J)、P53蛋白、Bcl-2蛋白、CYFRA21-1、和CD24蛋白等。,2酶类：,神经特异烯醇化酶(NSE)、肌酸激酶同工酶(CK-BB)、乳酸脱氢酶(LDH
4、)、-谷氨酸转肽酶(-GT)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶（ALP）、谷胱甘肽-转移酶(GSTs)、1-抗胰蛋白酶(1-AT)、-岩藻糖苷酶(AFU)、半乳糖苷转移酶(GsI-T)、唾液酶基转移酶(ST)等。,3 激素类：,绒毛膜促性腺激素（HCG）降钙素（CT）肾上腺皮质激素（ACTH）,4 细胞刺激因子：,转化生长因子(TGF)表皮生长因子(EGF)骨肉瘤生长因子(OGDF),5 受体类：,激素受体：如雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)细胞膜受体：如上皮细胞生长因子受体(EGFR)和erB2受体等,6 癌基因：,-alb基因、Neu基因、myc基因族、Ras基因族、-sis和-gs
5、p等。,7 抑癌基因：,RB基因、P53基因、P16基因和DDC基因等。,8 其他：,超氧化物歧化酶(SOD)、DNA聚合酶(DNA-P)、血清唾液酸(SA)、胃泌素、尿伪尿核苷和血清促肾上腺皮质激素原氨基端肽(-POMC)等。,二 TM的标记免疫测量技术,放射性标记免疫技术：用放射性核素125标记抗原或抗体，主要有放射免疫分析法和免疫放射分析法两种。非放射性标记免疫技术：用酶、化学发光物质、荧光素、鲁米诺或镧系稀土元素等作为标记物。主要有酶免疫分析、化学发光免疫分析、荧光免疫分析、时间分辨荧光免疫分析和金属离子免疫分析等。,三 几种重要TM的特性及其临床应用,影响因素：肿瘤标志物具有特异性和
6、非特异性的双重特点。各种肿瘤特性的不同，如肿瘤的分期、大小、定位、组织来源及转移趋向等的不同。各种抗体的不同，如多克隆抗体、单克隆抗体、抗体决定簇和抗体亲和性等的不同。各种检测系统的不同，如检测原理、标记物、实验条件、检测技术、检测仪器和检测敏感度等的不同。检验人员的专业水平和技术经验、以及实验室条件和实验的可靠性等的差异。,1 甲胎蛋白（AFP）,分子量约为7万的糖蛋白，由590个氨基酸组成，存在于胎儿肝脏和卵黄囊。主要用于原发性肝癌的诊断和分类，以及非精原睾丸癌、畸胎瘤等的诊断，是唯一一种和癌症有明确特点关系的TM。在妊娠妇女和某些肝炎、肝硬化病人中轻度增高。利用亲和电泳和免泳固定技术可将
7、AFP分为1、2、3型。其中3型是肝细胞癌早期特异性标志物,在检测小肝癌和区别肝癌与良性肝病有很大价值。某些病理类型的肝癌(如假腺管型)细胞可能不分泌AFP。,2 癌胚抗原（CEA）,分子量约180万的多糖蛋白复合物，位于胚胎和胎儿期的肠粘膜中。分泌CEA的肿瘤大多位于空腔脏器。首选为结、直肠癌的标志物，特别是大肠癌，其次为胃、肝、肺、胰和乳腺癌的标志物。腺癌常高于上皮癌。未患癌人群中吸烟者有轻度增高。胰液和胆汁内CEA 含量可用于诊断胰腺或胆道癌，尿液中CEA含量可作为判断膀胱癌预后的参考。血清CEA结合甲状腺钙素测定，有助于甲状腺髓样病的诊断和复发的估计。,3 血清2微球蛋白（2-MG）,
8、分子量为11500的低分子量蛋白，为淋巴细胞、巨噬细胞分泌。临床用于诊断多发性骨髓瘤。在肾功能不良时也升高。,4 血清铁蛋白（SF）,分子量为43-45万的大分子蛋白，作为储存铁，存在于肝、脾和骨髓中。临床为诊断隐性贫血较灵敏的指标。癌细胞具有较强合成SF的能力，可协助对肿瘤的诊断和预后估计。,5 前列腺酸性磷酸酶（PAP）和前列腺特异抗原（PSA）,PAP为分子量约十万的糖蛋白，酸性磷酸酶同功酶之一,是细胞的溶解体和分泌物的正常成分。具有组织特异性，主要用于诊断前列腺癌。PSA是前列腺上皮细胞分泌的一种激肽释放酶样的蛋白酶，分子量为33000的单链糖蛋白。前列腺癌时PSA检出率为70%90%
9、，在良性前列腺组织增生和女性乳腺癌时也可升高。F-PSA占T-PSA10%20%，前列腺癌时结合型PSA显著增加，故F-PSA/T-PSA比值下降。,6 人绒毛膜促性腺激素（HCG）,由胎盘滋养层细胞所分泌的一类分子量为4.5万的糖蛋白类激素，含有145个氨基酸，由两个独立的氨基酸肽链及亚单位组成。肿瘤细胞以分泌亚单位为特征。是绒毛膜上皮癌和恶性葡萄胎的肿瘤标志物。在性腺器官如卵巢、睾丸等发生胚胎性癌时也可检出，可作为这些疾病的疗效监测和预后判断。少数肺癌、子宫内膜癌、子宫颈癌和白血病等恶性肿瘤亦能发现-HCG升高，但阳性率不高。,7 神经特异性烯醇化酶（NSE）,是烯醇化酶的一种同工酶，分子
10、量约为87000，是神经元、神经内分泌细胞中参与糖酵解的酶。肿瘤组织中糖酵解作用加强，细胞增殖周期加快，细胞内的NSE释放进入血液，导致在血清中含量增加。是小细胞肺癌首选的TM(敏感性70%80%)。在神经母细胞瘤时升高。脑脊液中NSE可作为脑损伤、脑梗死的诊断指标。,8 细胞角蛋白相关,细胞角蛋白(CK)参与构成上皮细胞骨架。依其氨基酸序列不同分为CK1CK20共20种。Cyfra21-1为角蛋白19的片断，适用于非小细胞肺癌(总的敏感性52.9%)的诊断，尤其是鳞癌。,9鳞状上皮癌相关抗原（SCCA）,为组织抗原，可由妇女生殖道上皮以及不同器官的磷状上皮癌分泌。为宫颈鳞癌的首选TM，也用于
11、肺、食管、口腔、颌、面鳞癌，敏感性比Cyfra21-1低。,10胃蛋白酶原、（PGI、II),PG见于胃底粘膜的主细胞、颈粘液细胞及主颈粘液移行细胞；PG见于胃底腺主细胞、幽门腺、十二指肠腺。胃几乎是PG的唯一来源，PG变化能够反映出胃粘膜功能变化。胃癌患者血清PG、G/比值明显下降。日本学者以血清PG70ng/ml、PG/PG比值3为临界值,对胃癌的敏感性和特异性分别为84.6%和73.5%。在对一万余人进行健康体检筛查时发现,有20%左右的人PGI水平降低,进一步作胃镜检查,确认胃癌21例,其中早期胃癌19例。,11 糖类抗原(CA),CA19-9属糖脂，其中粘蛋白分子量为106，抗原为3
12、.6104，由各种癌细胞、胎儿胃肠道、上皮和一些粘液细胞产生。在由内胚层细胞分化来的多种上皮类恶性肿瘤血清中均可见升高。主要用于诊断消化道肿瘤，以胰腺癌的特异性最高，其次为结、直肠癌。,CA125 为分子量20万的糖蛋白，由卵巢癌上皮、胎儿及成人支 气管上皮分泌，用于卵巢癌的诊断和治疗检测。CA15-3 为两株McAb识别的糖类抗原，1株来源于乳汁脂肪酸，分子量为40万，另1株来源于乳腺癌细胞，分子量为2万9千，主要用于乳腺癌和卵巢癌等的诊断。是监测乳腺癌病人术后复发的最佳指标，尤其对原发性和转移性病变。对乳腺癌复发的早期预报较CEA更具灵敏性,并可显著提高乳腺癌预后评价的准确性。配合骨扫描，
13、更可及时发现骨转移。,CA50 为CA19-9的前体，是一种唾液酸酯和唾液酸糖蛋白，一般不存在于正常组织中。当细胞恶变时,由于糖基化酶失活或某些胚胎期才活跃的转化酶又被激活,造成细胞表面糖结构性质变化,形成CA50。各种恶性肿瘤均有一定的阳性率，需结合其他TM联合测定以提高诊断率。对于胰腺癌的敏感性和特异性都不如CA19-9。CA242与CA50来自相同的大分子，结构不同。主要用于胰腺、肝、结直肠和胃癌等的诊断。对胰腺癌的特异性和敏感性高于CA199。,12 生长激素（HGH）,HGH是一种蛋白质类激素，由脑垂体分泌，通过血液传输到全身。恶性肿瘤所分泌的异位激素，如垂体腺瘤、肾、肺等器官肿瘤均
14、会引起HGH含量的升高，因此HGH的检测有利于肾癌、肺癌及垂体瘤的联合诊断。,13 其他,组织多肽抗原（TPA）作为组织相关抗原，主要用于消化道肿瘤、肺癌和乳腺癌等的诊断。组织多肽特异性抗原（TPS）更能提供肿瘤复发、转移和进展的信号。膀胱癌抗原（UBC）主要用于膀胱癌的诊断。,四 多种TM的联合检测及临床应用,一般肿瘤治疗后4-8周，如果TM的浓度明显降低至正常水平，则表明肿瘤已基本消除；如果浓度降低很少，甚至不降低，则表明肿瘤还在增生或治疗后复发，也可能发生转移。目前单一标志物的检测灵敏度及特异性尚难满足临床对早期诊断、疗效及预后评估的要求，故多采用联合检测的方法。,1 肝癌 首选AFP、
15、CEA和CA19-9，AFP是原发性肝癌诊断、鉴别诊断、疗效及预后评估的必测指标，阳性率大于90%。CEA对于继发性肝癌具有良好的诊断率。其他如-谷氨酸转肽酶(-GT)、CD24。近年来开展了应用RT-PCR技术扩增AFP基因转录RNA来进行诊断原发性肝癌，其阳性率为36%。肺癌 小细胞肺癌(SCLC)一般首选CEA和SCC；非小细胞性肺癌(NSCLC)一般首选NSE、CEA和降钙素(CT)。,1 前列腺癌 首选PAP、PSA和F-PSA。在良性前列腺肥大中有一定的阳性率，近年来又提出PSA密度、PSA周转率和PSA/-精浆蛋白比值等指标，以提高诊断前列腺癌的阳性率。此外开展了PCR检测PSA
16、 RNA和RT-PCR检测前列腺特异性膜抗原(PSM)等的研究工作。乳腺癌 首选CA15-3和CEA，其他的TM对乳腺癌的早期诊断阳性率较低。CA15-3主要用于监测乳腺癌的活动。胰腺癌 首选CA19-9和CEA等。在胰腺癌病人中CA19-9、CA242和CA50的阳性率分别为65%-79%,71%-95%和71%-92%。目前已开展组织和血清的-ras基因检测来诊断胰腺癌的研究。,胃癌：首选CEA、CA72-4和CA19-9。卵巢癌：首选CA125,CEA和CA72-4。子宫颈癌：首选SCC,CEA和HCG。睾丸癌：首选HCG、CEA和AFP等。膀胱癌：首选TPA和CEA等。,恶性肿瘤相关物
17、质(TSGF)联合检测,TSGF检测药盒（福建新大陆生物公司），为几种肿瘤标志物的组合叠加，试剂的几种指标共同显色，增加了显色深度，实现了早期、广谱诊断肿瘤的目的。综合国内检测结果，TSGF检测恶性肿瘤的灵敏度为85.6%(19636/22945)，特异性为94.6%(3436/3631)。,五 遗传标志物检测的临床应用,遗传标志物（基因肿瘤标志物）：在正常细胞转化成恶性细胞的整个演变过程，均涉及到癌基因及相关基因的活化、抑癌基因的失活以及某些染色体片段的丢失。,几种新的肿瘤标志物,NMP22（nuclear matrix protein 22）核基质蛋白22。膀胱移行上皮癌患者尿液中NMP2
18、2明显高于正常人，有80%的特异性和准确性。尿路损伤可暂时、轻微升高。为非侵入性操作，对上尿路肿瘤的筛选有优势，特别适合复发患者的随访。2000年FDA通过的ELISA试剂盒，标本为尿液，血尿对检测无影响。,NMP22与细胞学诊断膀胱肿瘤的敏感性的比较（G为恶性程度）,Survivin,为凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP），正常终末期细胞不表达，胚胎期及肿瘤细胞表达。各种肿瘤细胞都有一定的阳性率。特别是对膀胱移行上皮癌有100%的阳性率（RT-PCR），特异性90%。现有ELISA试剂盒（尿液标本），优点同上。,uPM3,检测PCA3。PCA3是一个特异在前列腺癌表达的蛋白质，而且表达量大。通过检测尿液中PCA3是诊断前列腺癌的又一新指标。uPM3试验的特异性和敏感性都超过tPSA仅次于前列腺活检。,
