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1、液相色谱-质谱联用仪简介,市政环境工程学院化学与分析测试实验室陈忠林,主要内容,液相色谱-质谱联用面临的难题 液相色谱-质谱联用仪的几种常见接口液相色谱-质谱联用仪的应用,液相色谱-质谱联用仪的定义及用途,液相色谱-质谱联用仪：利用液相色谱对混合物的高效分离能力和质谱对纯化合物的准确鉴定能力而开发的分析仪器，简称LC-MS。高极性、热不稳定性、高分子量、低挥发度有机物（占90%以上）需要用LC-MS分离鉴定。,与GC-MS相比LC-MS研究起步更晚接口面临更大的难题：如何去除流动相（液体的去除比气体更困难）真空泵抽液体的速度：一般10-20uL/min；最大的低温泵也只有100uL/minHP
2、LC流动相流速：0.5mL-10mL/min,LC-MS的发展,分析物的电离问题：LC分析的大多是极性高、挥发度低、易分解或大分子量的化合物，经典的EI和CI并不适用于这些化合物。理想的接口：解决去出LC溶剂和分析物电离两方面的问题。,LC-MS的发展,LC-MS是在研究出热喷雾电离（TSI）、大气压化学电离（APCI）、特别是电喷雾电离（ESI）等方法后，才取得突破性的发展先后提出过近30种接口（interface）技术，目前在一定程度上使用的有：热喷雾（TS）、离子束（PB）、连续流动快原子轰击（CFFAB）、大气压化学电离（APCI）、电喷雾（ES）等几种。,LC-MS的发展,热喷雾接口
3、：Thermospray,简称TS。对应LC-TS-MS。是一种将接口和电离结合在一起的技术。原理：LC流出物以1-2mL/min的流速进入TS探针中心的不锈钢毛细管（0.1mm内径，1.6mm外径），在毛细管出口前受到剧烈加热溶剂快速蒸发，体积膨胀，以超音速喷出毛细管。（1）离子蒸发理,LC-MS接口 热喷雾接口及其原理,论：喷射的液体形成一个个由微小液珠、粒子和蒸汽组成的雾状混合体向下游扩散，一些在喷射过程中已带电荷的小液珠继续蒸发溶剂，表面迅速减小，当电荷与液珠表面积之比达到一个临界值（Rayleigh Limit）时，溶质以离子或离子聚合体的形式从液珠中解脱出去，进入气态，完成质谱分析
4、所需的电离。（2）气相离子-分子反应,LC-MS接口 热喷雾接口及其原理,理论：喷射液体中一般含有0.1M的挥发性电解质，常见的如醋酸铵，产生大量的NH4+和H3O+，CH3COO等正负离子，与分析物形成离子加成物，进入质谱进行分析鉴定。当前这两种理论仍在研究和争论中，实际上可能是两个过程的结合。,LC-MS接口 热喷雾接口及其原理,LC流出物的流速：最佳1ml/min左右。进行柱后分流或补充。辅助泵系统：抽气能力。TS探针温度：加热温度不适当，流体在毛细管中过早或过迟蒸发，影响喷射的形成和效果。通常设在低于完全蒸发拐点5-10，流动相蒸发程度为95%。对于梯度洗脱，加热温度应程序性变化。,L
5、C-MS接口 热喷雾接口操作要点,流动相：水、甲醇、乙腈、乙醇、正丙醇、异丙醇、二氯甲烷、乙烷、正辛烷。缓冲试剂：醋酸铵、甲铵、氢氧化铵、醋酸、三乙胺、三氟醋酸、一些低浓度离子对试剂（如十六烷基三甲基氢氧化铵、四丁基氢氧化铵、碳酸铵等）,LC-TS-MS分析中常用流动相和缓冲试剂,PFTBA已不适用。通常用聚丙二醇（PPG）。影响因素：探针温度、离子源温度、质谱调试。灵敏度：ug-pg范围。,LC-TS-MS分析中所用标准物、影响因素及灵敏度,生化、药物、环保领域中分析中等极性以上的化合物。化学和生物药品及它们的代谢产物、化疗药品和试剂、人体某些腺素、生物碱、甾类、多肽、核苷、磷脂、诱变剂、真
6、菌毒素、杀虫剂、除草剂、加热后食品、碳水化合物、表面活性剂和其它共轭体、染料、聚合物、田加剂、环氧树脂等。,LC-TS-MS的应用,粒子束接口：Particle Beam，简称PB。原理：根据流体力学原理，将溶质转变成中性粒子，利用动量差与溶剂分子分开后，送入质谱电离。包括三个主要过程：形成气溶胶、脱溶剂、动量分离。,LC-MS接口 粒子束接口及其原理,气溶胶的形成：通过喷嘴完成。0.1-1ml/min的LC流出物经内层毛细管到达喷口时，在外层套管的惰性气体（常用He，1-2ml/min的流速）推动下，喷射成均匀的雾状扇形小液珠。脱溶剂：在一个加热至40-50 大金属筒内完成。喷射出来的气溶胶
7、骤然扩散，,LC-MS接口 粒子束接口及其原理,挥发度高的溶剂蒸发成气体，挥发度低的溶质形成直径小于微米的粒子或粒子集合体。部分溶剂蒸汽在扩散中遇到冷金属壁冷凝成液体通过漏口排走，部分溶剂蒸汽则与分析物的粒子束一起进入动量分离器。,LC-MS接口 粒子束接口及其原理,动量分离器：由脱溶剂室的尾喷管、两个反向排列的锥形分离器和两级泵组成。溶剂蒸汽和离子束从尾喷嘴出来后，以超音速膨胀，随即降成亚音速，分析物质量高，动量大，沿轴向以离子束的形式进入第一级分离器，气态溶剂分子和氦气质量低，动量小，被第一级泵抽走。,LC-MS接口 离子束接口及其原理,以上过程在第二级分离器和第二级泵再重复一遍，进一步将
8、残留溶剂排除，分析物离子束更加“干燥”。再进入连接动量分离器和质谱离子源的一段温度在200 左右的金属导管，进一步“干燥”，然后进入离子源，经EI或CI后供质谱分析。,LC-MS接口 离子束接口及其原理,LC流速：最佳为0.5ml/min左右。有机溶剂比例越高越好，水的比例越低越好。动量分离器的良好密封以及两级泵的高抽气能力。离子源温度较常规下的EI和CI稍高。样品量：ug-ng,LC-MS接口 离子束接口操作要点,主要用于分析非极性至中等极性的化合物。EI或CI分子量一般1000Da以下。分析过的化合物：农药和除草剂（三嗪类、甲氨酸酯类、苯脲类）、药物（阿司匹林、布洛芬、抗生素）、维生素、氨
9、基酸、甾族化合物、核苷、染料（偶氮类等）、聚合物田加剂、环境有害物。,LC-PB-MS的应用,LC-MS接口 电喷雾接口,电喷雾接口：Electrospray，简称ES。也是一种大气压电离方式。所以应称为大气压电喷雾电离接口API-ES。大气压电离：Atmospheric Pressure Ionization，简称API。将分析物首先在大气压条件下电离，然后送入高真空的质谱，带电荷的分析物可从大量的中性LC溶剂中被“萃取”（电吸引）入质谱。,原理：包括电喷雾、离子形成、离子输送三个过程。电喷雾：流速为0.5-5ul/min的LC流出物经过一内径为0.1mm施加3-8kV电压的金属毛细管，毛细
10、管尖端很窄，电场可高达106V/m，使流出物成扇状喷雾，成为细小液珠和溶剂蒸汽的混合体。由于高电场作用，溶液中带电荷的溶质会向液体表面移动，使液珠表面电荷过剩，其电荷正负由所加毛细管电压正负而定。,LC-MS接口 大气压电喷雾电离原理,离子形成：表面有大量电荷的细小液珠向下游移动时，溶剂迅速蒸发，液珠表面积缩小，电荷密度增高。当电荷与液珠表面积之比达到一个临界值（Rayleigh Limit）时，液珠会分裂成更小的液珠。更小的液珠再重复蒸发、电荷过剩、进一步分裂。分析物可能以单电荷或多电荷离子进入气相。,LC-MS接口 大气压电喷雾电离原理,离子输送：在大气压条件下形成的离子，在电位差和压力差
11、的作用下，离子流通过一个加热的金属毛细管进入第一个降压区，在毛细管出口处形成超音速喷射流，再经过下游处于低电位的锥形分离器小孔进入第二降压区，经聚焦后进入质谱真空区，进入质量分析器、检测器。,LC-MS接口 大气压电喷雾电离原理,LC-MS接口 大气压电喷雾电离接口,LC-MS接口 大气压电喷雾电离接口,LC-MS接口 大气压电喷雾电离过程,LC-ES-MS操作要点,LC液体流速：0.5-1000ul/min或更高，视不同厂家接口特点而定。溶剂范围很宽：100%有机溶剂到100%水相。接口操作参数：电喷雾电压、喷射液体流速、助气和气帘的流速、接口温度等。灵敏度：差异很大，对多肽、蛋白质类检出量
12、可达10-18 mole水平；对小分子量的极性化合物，在ng-pg/ul水平。,测定多肽、蛋白质类化合物分子量、氨基酸单位结构、序列。目前测量的蛋白质分子量已达108Dalton，测量精度达0.01%。核酸、碳水化合物、生物高聚物。生命科学、制药工业、临床诊断和治疗、工业聚合物、环境有害物、农业土壤等。,LC-ES-MS的应用,LC-MS接口 大气压化学电离接口,大气压化学电离接口：Atmospheric Pressure Chemical Ionization，简称APCI。原理：是将化学电离延伸到大气压下进行。与大气压电喷雾电离方式（API-ES）相似，包括LC液体喷射、离子形成、离子输送
13、三个过程。,LC液体喷射：APCI的喷嘴比ESI大，常用内径0.5mm金属毛细管，LC流体流速1-2ml/min。将毛细管加热到100-200 并用大流量气体推动，LC流体喷射成液珠和溶剂蒸汽混合体。,LC-MS接口 大气压化学电离接口原理,离子形成：通过加热喷射，有少量离子直接蒸发进入气相。但没有ESI的电离条件，直接蒸发成气态的分析物离子数量不足以给出质谱检测信号。在喷嘴下游放置一个针状电晕放电电极，通过其高电压放电，使气氛中某些中性分子电离，产生入H3O+、O2、O等。当喷射出的气溶胶混合物接近电极时，大量的溶剂分子也会被电离。大量的离子与分析物进行气态离子-分子反应，完成分析物的化学电
14、离。,LC-MS接口 大气压化学电离接口原理,离子输送：同上述ESI。,LC-MS接口 大气压化学电离接口原理,LC-MS接口 大气压化学电离接口,LC-MS接口 大气压化学电离过程,LC-APCI-MS操作要点,LC流出物：流速1ml/min以上可用；多数流动相可用；梯度洗脱可用；极性流动相有较好电离效果；100%水相可用。喷射预热：预热15min后，才能稳定工作；预热不够，LC流动相冷凝，离子强度低不稳定。灵敏度：多数在ng/ul；在分析物、反应试剂、操作条件适合时，可以到pg/ul甚至fg/ug。,氨基酸、抗生素、甾族化合物、糖、多肽、药物分析。,LC-APCI-MS的应用,LC-MS接
15、口 连续流动快原子轰击接口及原理,连续流动快原子轰击接口：Continous-Flow Fast Atom Bombardment,简称CFFAB。原理：将分析物溶入低挥发度的溶剂（底物matrix），以此混合物为靶子，用快原子（或离子）轰击靶表面，分析物离子和中性分子的形式从混合物表面连续解脱出来，进入气相，离子供质谱分析。,原理：混有少量FAB底物的LC流出物以小于5ul/minmm），毛细管顶端连接一个铜帽，铜帽上有一层网状金属薄片，液体流过时在网上均匀扩散形成一层液膜，构成FAB的靶子，以快原子或离子轰击。,LC-MS接口 连续流动快原子轰击接口及原理,LC-CFFAB-MS操作要点,
16、LC流出物：流速1-5ul/min附近。FAB底物：常用甘油；3-硝基苯醇、三乙胺、硫甘油也有少量报道。,LC-CFFAB-MS的应用及缺陷,分析挥发度低、极性高（包括离子化合物）、易分解和高分子量的化合物；分析1000-2000Dalton的多肽化合物、糖、有机金属化合物；只允许少量LC流出物进入质谱；“脏”技术：低挥发度底物。,常用LC-MS接口对化合物极性的适用范围,常用LC-MS接口对化合物分子量大小的适用范围,常用LC-MS接口对化合物热稳定性的适用范围,常用LC-MS接口对LC流动相流速的适用范围,LC-MS联用仪组成框图,GC-MS的实际操作,气相色谱分析应用示例,THE ENDTHANK YOU,
