细胞凋亡分子机制及检测.ppt

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1、细胞凋亡分子机制及检测,细胞发生代谢停止、结构破坏和功能丧失等不可逆性变化，此即细胞死亡。细胞死亡包括坏死和凋亡两大类型。相比起细胞坏死，细胞凋亡是更常见的细胞死亡形式。在20世纪70年代，科学家们发现了细胞凋亡，这一研究成果获得了2002年诺贝尔生理/医学奖。,有丝分裂 细胞增多 动态平衡细胞凋亡 细胞减少新生细胞出现，产生相应功能 机体 正常生原有的、不必要的、有害的细胞除去 长发育,细胞程序性死亡的概念是1956年提出的，PCD是个功能性概念，描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的，并受到严格程序控制的正常组成部分。特征:即散在地、逐个地从正常组织中死亡和消失,机体

2、无炎症反应，而且对整个机体的发育是有利和必须的。细胞程序性死亡是一个发育学概念，而细胞凋亡则是一个形态学概念，描述一件有着一整套形态学特征的与坏死完全不同的细胞死亡形式。但是一般认为凋亡和程序性死亡两个概念可以交互使用，具有同等意义。,凋亡概念的形成 1965年澳大利亚科学家发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一些散在的死亡细胞。这些细胞的溶酶体并未被破坏，显然不同于细胞坏死。这些细胞体积收缩、染色质凝集,从其周围的组织中脱落并被吞噬,机体无炎症反应。1972年Kerr等三位科学家首次提出了细胞凋亡的概念，宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始，在此之前，关于胚胎发育生物学、免疫系统的研究

3、，肝细胞死亡的研究都为这一概念的提出奠定了基础。,细胞凋亡的形态学及生物化学研究阶段（1972-1987）1）利用光镜和电镜对形态学特征进行了详细的研究。2）染色体DNA的降解：细胞凋亡的一个显著特征就是细胞染色质的DNA降解。3）RNA/蛋白质大分子的合成。4）钙离子变化，细胞内钙离子浓度的升高是细胞发生凋亡的一个重要条件。5）内源性核酸内切酶：细胞发生凋亡是需要这种核酸内切酶参与的。,细胞凋亡的分子生物学研究阶段1）细胞凋亡相关基因及其调控2）细胞凋亡的信号转导3）细胞凋亡各种分子相互作用及相互关系4)细胞凋亡的临床应用基础研究阶段 细胞凋亡的研究，其生命力在于最终能够有利于疾病机制的阐明

4、，以及新疗法的探索及问世。,细胞的生长发育、增殖、分化和死亡是细胞的4大特点，细胞死亡分为细胞凋亡和细胞坏死。细胞凋亡(apoptosis)是由死亡信号诱发的受调节的细胞死亡过程,是细胞生理性死亡的普遍形式。凋亡过程中DNA发生片段化，细胞皱缩分解成凋亡小体，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬，不发生炎症。,第一节 概述,一、细胞凋亡概念和特征,细胞坏死（necrosis）是在各种致病因素（如缺氧、物理、化学和生物学因素）的剧烈刺激下的病理性死亡。其特点是:引起死亡的因素剧烈，死亡迅速。表现为能量代谢下降膜通透性增加细胞水肿细胞器破裂，细胞溶解，DNA不断裂内含物释放引起炎症反应。,细胞凋亡:细胞在一定

5、的生理或病理条件下,遵循自身的程序,结束其生命的生理性死亡，是受基因严格调控的细胞自杀现象。凋亡过程中，细胞骨架蛋白分解细胞和细胞器浓缩而不裂解染色体DNA断裂和形成凋亡小体细胞内含物不外泄，不引起炎症反应。最后凋亡小体被巨噬细胞识别和吞噬。,细胞凋亡Apoptosis 和细胞坏死Necrosis,细胞凋亡的形态学特征,细胞：首先变圆，体积缩小，与邻近细胞的连接丧失，失去微绒毛，胞浆浓缩，细胞膜结构仍保持完整。细胞核的变化：胞核内染色质浓缩形成密集颗粒，位于核被膜下。细胞器：线粒体：保持完整呈正常状态 溶酶体：保持完整，内容物不外泄,形成凋亡小体：内质网、高尔基复合体及核被膜膨大,形成泡状结构

6、与细胞膜融合，以出泡方式离开正在死亡的细胞，将所包含的完整细胞器和核碎片等细胞内容物以细胞质膜包被成凋亡小体(apoptosis bodies）释放到细胞外。凋亡小体很快被周围邻近间质细胞或巨噬细胞吞噬，而不引起周围组织的炎症反应。,胸腺细胞,正常,凋亡,生物化学方面：核酸内切酶活化与DNA电泳呈梯子状改变是apoptosis的生物化学标志。核酸内切酶在核小体连接处将DNA链切断，从而最终产生寡聚核小体。这些寡聚核小体的大小均是DNA长度为180-200个碱基对(bp)的倍数，因此用琼脂糖凝胶电泳测定细胞DNA时出现特征性的“梯状”（ladder）带纹。,Ladder Pattern of A

7、poptotic Cells,二、细胞凋亡的生理意义,1.维持组织器官细胞类型和细胞总量的基本平衡：清除衰老损伤的细胞：皮肤、粘膜细胞的更新等。2.在胚胎发育中起重要作用 a 手指和脚趾的形成等。b 大脑神经元之间形成连接时多余的神经细胞通过凋亡清除掉。c 在淋巴细胞发育成熟中起重要作用。d 心脏发育过程中左右心室、房的形成以及左右心室的厚度，通过细胞凋亡调节。3.细胞凋亡异常可引起肿瘤和神经退行性病变等疾病。,未成熟B细胞（immature B cell）完成骨髓发育阶段后，进入血液循环。尽管它表达膜表面抗原受体，但不具备免疫活性。因此，在结合抗原后，细胞不被激活，而是通过凋亡被清除。只有经

8、过不同阶段的过渡期，分化为成熟B细胞，才具有免疫活性。过渡期B细胞的发育、成熟是受复杂的调控。一方面，细胞的生存机制促进未成熟B细胞的存活与发育，保证了B细胞成熟的顺利完成。另一方面，70%的细胞凋亡，消除潜在自身反应性B细胞，实现了对自身组织的免疫耐受。,由HIV感染引起的艾滋病有一个重要特征是随着病情的发展，CD4T细胞数进行性减少，其主要原因是：1，HIV感染细胞后产生一些调控性基因产物，这些产物使未被感染细胞对CD95介导的凋亡高度敏感（即通过Fas-FasL应答而使未被感染的细胞凋亡）；2，被HIV感染的CD4T细胞大量复制子病毒，导致细胞死亡，同时又使更多的细胞被感染。随感染时间的

9、延长造成免疫系统进行性损伤和崩溃。由此可见:HIV即可引起细胞凋亡也可引起细胞坏死.,一、半胱天冬酶（胱冬酶，caspase，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，cysteine-containing aspartate-specific protease),第二节 细胞凋亡相关基因和蛋白质,Caspase的含义表现在两个方面（）它们为半胱氨酸蛋白酶类，并且把半胱氨酸作为对底物裂解时的亲核基团；（）它们为天冬氨酸蛋白酶类，切割天冬氨酸的羧基与下一个氨基酸的氨基形成的肽键。,Asp 特异性半胱氨酸蛋白酶.caspase能够高度选择性地切割某些蛋白质，这种切割只发生在少数位点上，主要是在结构域间的位点上

10、，切割的结果或是活化某种蛋白，或使某种蛋白失活，但不完全降解一种蛋白质。是一类促进细胞凋亡的蛋白水解酶，在诱导细胞凋亡中起关键作用，成为细胞凋亡的“中心处理器”，即各种细胞凋亡信号通过传递最终激活胱冬酶，胱冬酶通过水解不同的蛋白质引起细胞凋亡。,1 Caspase的结构和功能,Caspase 共有十多种，结构相似，都以酶原的形式分泌。酶原水解激活后产生前结构域，大亚基和小亚基三部分，然后大小亚基聚合形成有活性的四聚体。N端结构域参与酶功能激活调节;大、小亚基提供与底物结合及催化所需的氨基酸。Caspase 可专一、高效地特异性水解一系列蛋白质底物,并导致蛋白质功能丧失或改变。,caspase

11、酶原 前结构域+大亚基+小亚基 大 异二聚体 小 大 大 异四聚体 活性形式 小 小,活化Caspase为四聚体，两个小亚基相邻排列，两个大亚基围绕在小亚基的周围；每一大小亚基形成一球状分子，球状分子的核心为个螺旋环绕的6个片层样结构。两个异二聚体以小亚基相连。每一活化Caspase分子含有两个酶活性中心，这两个活性中心可能独立发挥作用。,Crystal Structures of Human Caspases,Structure of Caspase-7 with Inhibitor,Caspase 作用：是一类蛋白水解酶，可特异水解底物蛋白分子中天冬氨酸残基羧基侧的肽键，从而激活该蛋白质或

12、改变蛋白质的活性，从而促进细胞凋亡。N A-B-C-D-X C 不同的Caspase对ABCD种类要求不同。,Caspase是细胞凋亡的执行者，引起细胞凋亡的各种因素通过凋亡信息传递途经最终激活caspase，caspase通过水解不同的蛋白质改变细胞特性，引起细胞凋亡。其中caspase 3 的作用最重要。但并非所有的凋亡过程都有caspase 的参与。,2 Caspase 的分类,（1）上游/启动型caspase:2、8、9、10，12 处于细胞凋亡信号传递途径的上游，在凋亡信号的刺激下首先被激活，然后再水解激活下游的caspase.（2）下游/执行型caspase:3、6、7 处于细胞凋

13、亡信后传递途径的下游，被上游caspase激活后直接水解与细胞凋亡有关的底物蛋白，引起细胞形态学和生物化学改变以及DNA的断裂。,3 Caspase的底物,1、细胞骨架蛋白：核纤层蛋白、肌动蛋白、核分裂相关蛋白等十几种蛋白。2、与DNA损伤修复相关的蛋白质和酶，阻止DNA损伤的修复。如：DNA依赖性蛋白激酶、DNA复制相关蛋白。3、激活DNA酶，促进DNA断裂。,二、死亡受体及相关蛋白 是一类参与外源性细胞凋亡途经的蛋白质：*死亡配体（细胞外）死亡受体（细胞膜）相关蛋白（中介蛋白，细胞内）激活caspase 诱导细胞凋亡,1 死亡受体(death receptor,DR),死亡受体是一类跨膜蛋

14、白，与其配体结合后可把凋亡信号传递到细胞内部。主要的死亡受体是TNF-R超家族；配体 死亡受体 TNF-TNF-R1 FasL Fas（CD95/APO-1）APO-3L DR-3（WOL-1）APO-2 DR-4（TRAIL-R1）TRAIL DR-5（TRAIL-R2）（TNF相关的凋亡诱导配体，TNF-related apoptosis-inducing ligand）,caspase激活的DNA酶（caspaseactivated deoxyribonuclease，CAD）,ICAD（inhibitor of CAD）,死亡受体相关蛋白（中介蛋白/接头蛋白）,是连接死亡受体和casp

15、ase的中介蛋白，把凋亡信号从死亡受体传递给caspase。(1)FADD（Fas相关的死亡结构域蛋白，Fas associated death domain protein)由两部分构成,介导Fas和TNFR1两种受体的细胞凋亡信号:A 死亡结构域：与Fas的DD相互作用 B 死亡效应区：与启动型caspase2、8、9、10作用,(2)TRADD（TNFR-1 相关死亡结构域蛋白）从TNFR-1接受死亡信号，然后传递给FADD.This protein can also interact with receptor FAS,and is involved in the Fas-induce

16、d cell death pathway,三、凋亡蛋白酶激活因子类（apoptosis protease activation factor,Apaf）,一类促进细胞凋亡的蛋白因子，参与细胞凋亡的线粒体信息传递途经。细胞凋亡与线粒体膜电位及通透性改变有关。凡是诱导细胞凋亡的因素，都可使线粒体的膜电位下降，膜通透性增加，线粒体膜通透性转运孔（MPT）开放，释放出多种可激活caspase的蛋白因子，包括细胞色素c(Cytc)，凋亡诱导因子(AIF)。,1 细胞色素c（Cytc）,细胞色素c是呼吸链的重要成员，是由线粒体DNA编码的蛋白质。细胞凋亡信号 线粒体膜通透性增加，Cytc 释放到胞浆 与A

17、paf-1和caspase-9结合成复合体，诱导凋亡。,2 凋亡蛋白酶激活因子-1（Apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1）,在正常情况下Apaf-1以无活性的单体存在于细胞质，在凋亡信号的作用下，其N-端与Caspase-9结合，其C端与细胞色素C结合。形成Cytc-Apaf-1-Caspase-9 复合体-凋亡酶体（apoptosome)。首先激活caspase-9，然后激活下游的caspase 3，6，7等，诱导细胞凋亡。,3 凋亡诱导因子（Apoptosis inducing factor,AIF）,凋亡诱导因子是一类存在于线粒体内外

18、膜间隙的保守的黄素蛋白，具有双重功能。在细胞正常的生理状态下，AIF作为线粒体氧化还原酶，能催化细胞色素c（Cyt-c）和NAD之间的电子传递，当细胞受到凋亡的刺激时，线粒体膜通透性改变，AIF从线粒体转位到核内，与线粒体蛋白质endonuclease G(Endo G)一起引起细胞染色体的凝聚和DNA大的片段化。,apoptosis-inducing factor,四、Bcl-2家族,Bcl-2家族成员都含有1-4个Bcl-2同源结构域（BH1-4），并且通常有一个羧端跨膜结构域(transmembrane region,TM)。其中BH4是抗凋亡蛋白所特有的结构域，BH3是与促进凋亡有关的

19、结构域。根据功能和结构可将Bcl-2基因家族分为两类，一类是抗凋亡的（anti-apoptotic），如：Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1；一类是促进凋亡的（pro-apoptotic），如：Bax、Bak、Bad、Bid、Bim，在促凋亡蛋白中还有一类仅含BH3结构，如Bid、Bad。,（一）Bcl-2和Bcl-xl,1 为膜结合蛋白2 降低线粒体膜通透性，抑制Cytc、AIF等释放。4 抑制自由基的产生，抑制氧化剂对细胞凋亡的诱导作用。5 许多抗癌药物如紫杉醇可使bcl-2磷酸化而失活。从而诱导肿瘤细胞凋亡。6 HIV病毒蛋白水解酶可水解Bcl-2,诱导T淋巴细胞凋亡。,虽

20、然Bcl-2蛋白存在于线粒体膜、内质网膜以及外核膜上，但主要定位于线粒体外膜，它拮抗促凋亡蛋白的功能。而大多数促凋亡蛋白则主要定位于细胞质，一旦细胞受到凋亡因子的诱导，它们可以向线粒体转位，通过寡聚化在线粒体外膜形成跨膜通道，或者开启线粒体的PT孔，从而导致线粒体中的凋亡因子释放，激活caspase，导致细胞凋亡。,（二）Bax、Bcl-xs、Bad,1 Bax在线粒体外膜形成寡聚体，形成通道使线粒体膜的通透性增加，促进CytC、Apat-1等的释放，激活caspase，促进凋亡。2 当细胞内Bax含量远大于Bcl-2和Bclxl时，Bax 自身形成的二聚体BaxBax，可诱导细胞凋亡。3 在

21、凋亡信号作用下，p53表达升高，p53进一步诱导Bax表达增加，诱导细胞凋亡。,bcl-2 二聚体抑制凋亡，促进细胞增殖,bax 二聚体促进凋亡,p53 促进 bax 蛋白的合成,BcL-2家族抑制和促进细胞凋亡两类蛋白的比例决定了细胞在受到凋亡信号刺激时是否发生凋亡,第三节 细胞凋亡通路,目前发现细胞凋亡有3条通路：死亡受体通路线粒体通路内质网通路,第三节 细胞凋亡通路,1 死亡受体通路（外源性凋亡途经）,过程：配体（TNF/FasL)死亡受体 接头蛋白（FADD/TRADD）caspase-8(caspase-10)凋亡酶体（apoptosome)caspase-8(caspase-10)

22、自身切割激活 激活caspase-3 细胞凋亡。,一、细胞凋亡的三条通路,2 线粒体通路（内源性凋亡途经）,过程：活性氧（氧自由基）/DNA损伤 Bax穿入线粒体膜 cyt C 漏出线粒体 cyt C+Apaf-1+caspase-9+ATP 凋亡酶体（位于细胞液）caspase9自身切割激活 水解激活caspase-3 细胞凋亡,3 内质网通路,过程：内质网（ER)内Ca2+错误折叠的蛋白质积累 ER膜上Bax和Bak聚集 激活膜上的caspase-12（自我切割）水解激活caspase-3 细胞凋亡,二、细胞凋亡通路的调节,1P53是一种很重要的抑癌基因，其蛋白产物是转录因子，是一种很强的

23、细胞凋亡诱导因子。诱导p21表达、抑制细胞增殖。p53 对死亡受体通路和线粒体通路均有调节作用。p53 Bax bcl-2 线粒体膜通透性增加 细胞凋亡 Fas表达增加，Fas-FADD复合物增加细胞凋 亡。,2.Bcl-2家族对线粒体通路和内质网通路有调节作用。Bcl-2家族：（1）在线粒体外膜形成寡聚体，影响膜通透性，影响凋亡；（2）聚集在内质网膜上，影响膜通透性降低，影响内质网内钙离子积累，影响细胞凋亡。,第四节 细胞凋亡的检测,一、细胞凋亡的形态学检测 1、光学显微镜和倒置显微镜（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。（2）染色细

24、胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。,（放线菌素D）,姬姆萨染色（肝组织）。A：对照组；B：处理组，凋亡细胞核染色质致密分布于核膜下。,A,B,图1光学显微镜所见：箭头所示细胞膜皱缩，细胞核裂解成大小不一的核片段。瑞氏染色400图2透射电子显微镜所见：箭头所示大量凋亡小体形成，其内可见致密染色质和完整细胞器。透射电子显微镜8000,2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜(一种高级的荧光显微镜)一般以细胞核染色质形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：Hoechst 33342，Hoechs

25、t 33258,DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；b期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。,3、透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构；a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；b期细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。,（人外周

26、血白血病T细胞）,二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。,Annexin V/PI双染色法,PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的

27、差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料以检测细胞膜完整性的检测方法。,碘化丙啶(propidine iodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期细胞和死亡细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及坏死细胞区分开来。,结果判断：在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡

28、细胞，显现（FITC+/PI-）。,三、线粒体膜势能检测 线粒体跨膜电位的下降被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。JC-1染料在正常细胞内聚集在线粒体内，形成多聚体，发红色荧光；而在凋亡细胞内，由于线粒体膜电位的破坏，不能聚集到线粒体内，以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光。荧光显微镜或流式细胞仪检测。,用凋亡诱导剂诱导P388细胞凋亡，在37，5%CO2培养箱培养46h，利用细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）进行检测，通过流式细胞仪分析。,四、DNA片断化检测 细胞凋亡时主要

29、的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成50300kbp长的DNA大片段,或180200bp整数倍的寡核苷酸片段。大分子染色体DNA片段的测定 细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50300kbp长的DNA大片段。其不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术。,180200bp整数倍的寡核苷酸片段在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶

30、使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。,五、末端转移酶标记技术-TUNEL法 细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）。正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，没有3-

31、OH形成，很少能够被染色。,TUNEL技术检测BAK基因过表达后癌细胞凋亡,TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。,六、Caspase-3活性检测 Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致

32、细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。,1、Western blot 分析 分析Procaspase-3，活化的Caspase-3及其对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶poly（ADP-ribose）polymerase，PARP等的裂解。,2、荧光分光光度计分析原理：活化的Caspase-3能够特异切割D(Asp)1E(Glu)2V(Val)3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。,七、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含 有核小体2、在微定量板上吸附抗组蛋白抗体3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合4、加辣根过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合5、加酶的底物，测光吸收。,