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1、致泻性大肠杆菌检验技术,概 念,大肠杆菌的部分血清型可引起肠道感染，称为致泻性大肠杆菌,致泻性大肠杆菌按照毒力因子、致病机理和流行病学特征分为5类肠致病性大肠杆菌（EPEC）肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）肠产毒性大肠杆菌（ETEC）肠出血性大肠杆菌（EHEC）肠聚集性粘附大肠杆菌（EAggEC）,生物学性状,形态大肠杆菌是革兰氏阴性短杆菌，大小为1.01.5m2.0 6.0m多有鞭毛，约为4 6根，为周毛菌。没鞭毛的细菌也可使人或动物致病大肠杆菌具有菌毛，分为性菌毛、普通菌毛和与致病性有关的菌毛。与细菌致病性有关的菌毛有：K88、K99、987P、CFA、F41 CFA等,培养特性,大肠杆菌在普
2、通营养琼脂上生长良好，最适生长温度为37，42 44 仍能生长。兼性厌氧菌，氧气充足生长较好。最适生长pH为6.8 8.0，低于6.0或高于8.0生长缓慢。,在普通培养基上的菌落形态,光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑，呈灰色，在生理盐水中容易分散。粗造型：菌落扁平，边缘不整齐，易在生理盐水中自凝。粘液型：常为含有荚膜的菌株。,生化特征-1,分解乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖等多种糖类，产酸产气。在肠道鉴别培养基上形成有色菌落。吲哚试验、甲基红试验阳性；V-P试验阴性；不能利用柠檬酸盐作为碳源；分解葡萄糖铵盐；不分解尿素；明胶液化阴性；不分解侧金盏花醇；在氯化钾培养基上
3、不生长。,生化特征-2,EIEC：不发酵或迟缓发酵乳糖，不产气，除O124外无动力；乳糖、蔗糖不产酸或产酸，葡萄糖产酸产气或不产气，H2S阴性，靛基质阳性，酒石酸盐阴性，赖氨酸脱羧酶阴性。O157：H7大肠杆菌不发酵山梨醇或迟缓发酵，在CT-SMAC平板上菌落为白色；绝大多数不具有葡萄糖醛酸酶，不能水解4-甲基伞形花内酯-D葡萄糖酸苷，不能产生荧光；绝大多数EHEC发酵棉子糖、卫矛醇，能够利用鸟氨酸赖氨酸，其他大肠杆菌中20%左右发酵棉子糖，50%左右发酵卫矛醇，有部分大肠杆菌不能利用鸟氨酸赖氨酸。,抗原结构,大肠杆菌的表面抗原包括菌体抗原（O抗原）、鞭毛抗原（H抗原）、荚膜抗原（K抗原）O抗
4、原即细胞壁外膜上的脂多糖（LPS），目前已发现O抗原有170多个血清型，H抗原有55种左右。最初分离的菌株动力往往较差，与H抗血清的反映凝集差，需在半固体培养基上传代以利于鞭毛的生长。,致病物质与所致疾病,在肠道内一般不致病，但如果移位侵入肠道外的组织或器官可引起肠外感染，以化脓性炎症最为多见。引起泌尿系统感染的大肠杆菌称为泌尿道致病性大肠杆菌（UPEC），引起尿道炎、膀胱炎、肾盂肾炎。一些大肠杆菌还引起腹膜炎、胆囊炎、阑尾炎、手术创口感染等。在婴幼儿、老年人或免疫力极低的病人中可引起败血症。,肠产毒性大肠杆菌ETEC是第三世界国家细菌性腹泻和旅游者腹泻的主要病原之一ETEC分泌耐热肠毒素（S
5、T）、不耐热肠毒素（LT），具有与致病性相关的菌毛等。ETEC通过菌毛粘附在小肠上皮细胞，释放毒素ST和LT，刺激腺苷环化酶或鸟苷环化酶的生产，引起肠液分泌和聚积，产生水样腹泻。,肠侵袭性大肠杆菌EIEC的毒力因子和致病机制志贺氏菌基本一致，临床症状与细菌性痢疾不易区分，主要是发烧、腹部剧烈疼痛与不适、毒血症、水样腹泻，粪便中有少量粘液和血。EIEC通常侵犯大肠，使大肠上皮细胞刷状缘发生局部破坏，细菌被摄入细胞内，侵犯并破坏细胞基底膜，在细胞内扩散、繁殖，并在细胞间扩散，引起细胞的死亡，造成炎症和溃疡。EIEC的侵袭力由120140MD的大质粒编码，与编码志贺氏菌侵袭力的大质粒高度同源，丢失了
6、质粒的菌株也随之丧失。,肠致病性大肠杆菌EPEC是婴幼儿腹泻的主要病原菌，主要临床症状是发烧、呕吐、腹泻，粪便中含有大量粘液而无血，症状可持续两周以上，多引起社区的小型暴发。主要毒力因子包括5070KD大质粒编码的束状菌毛介导的粘附作用、噬菌体编码的志贺毒素及LEE毒力岛介导的A/E损伤。,肠出血性大肠杆菌EHEC是指能引起出血性肠炎的一群大肠杆菌，包括、026:H11、0111:H8、O125：NM、O122:H19等血清型的部分菌株。目前认为EHEC的主要毒力因子有志贺毒素、致病性大质粒和LEE毒力岛。,肠聚集性粘附大肠杆菌（EAggEC）EAggEC主要与小儿顽固性腹泻有关 EAggEC
7、产生束状菌毛（AFF/）和聚集性粘附大肠杆菌毒素（EAST）AFF/和EAST 的基因位于60MD质粒上,样品的采集与处理,肠道外感染患者，应根据感染情况采取中段尿、血液、脓液、脑脊液、胆汁等。食品样品采集后应尽快检验，易腐食品在检验之前应予冷藏。粪便标本一般采集13ml水样便或血样便，成形便约25g左右或用棉拭子采样，粪便标本应尽快送检，如运送时间超过2h，标本应放在Cary-Blair运送培养基内，4条件下送检。,EPEC：婴幼儿水样或蛋花样便EIEC：细菌性痢疾样便ETEC：霍乱样水样便EHEC：早期为水样便，后为血便,检验程序,肠道增菌肉汤,检样,麦康凯,371 18-24h,乳糖发酵
8、或不发酵的菌落3-5个、氧化酶，G杆菌,TSI、靛基质、pH7.2尿素、KCN、赖氨酸、动力,TSI底部+，H2S-，KCN-，尿素-,如非左述的反应结果,血清学试验进一步鉴定,非大肠埃希氏菌,报告,直接分离培养,新鲜粪便标本接种下列培养基麦康凯（Mac）或伊红-美蓝等弱选择性鉴别培养基。山梨醇-麦康凯琼脂或O157显色培养基，肠出血性大肠杆菌及某些致病性大肠杆菌不发酵或迟缓发酵山梨醇，菌落为无色。血琼脂平板，用于观察肠致病性大肠杆菌的溶血及其他菌落的鉴别，37培养18-24h观察结果。,增菌培养,对于怀疑肠出血性大肠杆菌O157:H7感染标本，应无菌称取25g食品或环境采集样品，加入225m
9、l mEC+n（m为modified“改良的”的缩写，n为novobiocin“新生霉素”的缩写）肉汤中，37增菌培养6h，免疫磁珠捕获后转种于改良的O157显色培养基或CT-SMAC，37培养18-24h观察结果。注：C：头孢克肟0.05mg/L T：亚碲酸钾2.5mg/L n：新生霉素0.02g/L,磁珠分离,将Ep管按样品和质控菌株进行编号，每个样品使用1只Ep管，然后插入到磁板架上。在漩涡混合器上轻轻振荡E.coliO157免疫磁珠溶液后，用开盖器打开每个Ep管的盖子，每管加入20LE.coli O157免疫磁珠悬液。注意：磁珠在加入前在混旋器上短暂混匀，不可剧烈震荡，避免产生泡沫。取
10、mEC+n肉汤增菌培养物1mL，加入到Ep管中，盖上盖子，然后轻微振荡10s。每个样品更换1只加样吸头，质控菌株必须与样品分开进行，避免交叉污染。注意:取样前混匀，避开脂肪层与杂质，必要时使用滤网。加样后立即混匀。对照同时做。,结合：在1830环境中，将上述Ep管连同磁板架放在适合的装置上转动或用手轻微转动10min，使E.coli O157与免疫磁珠充分接触。注意：室内温度，保证结合时间。结合时不要将磁铁插入到磁板架中。用手转动时应轻轻颠倒Ep管架，不可剧烈摇动。保证磁珠与O157的结合。,捕获：将磁板插入到磁板架中浓缩磁珠。在3min内不断地倾斜磁板架，确保悬液中和盖子上的免疫磁珠全部被收
11、集起来，此时，在Eppendorff管壁中间明显可见的圆形或椭圆形棕色聚物。吸取上清液：取1支灭菌的加长吸管，从免疫磁珠聚集物对侧深入液面，轻轻吸走上清液。当吸到液面通过免疫磁珠积聚物时，应放慢速度，以确保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液内含有磁珠，则应将其放回到Eppendorff管中，并重复2.4步骤。每个样品换用1支加长吸管。,免疫磁珠的滑落：某些样品特别是那些富含脂肪的样品，其磁珠积聚物易于滑落到管底。在吸取上清液时，很难做到不丢失磁珠，在这种情况下，可保留50100L上清液于Eppendorff管中。如果在后续的洗涤过程中也这样做的话，脂肪的影响将减小，也可达到充分捕获的目的。洗涤：
12、从磁板架上移走磁板，在每个Eppendorff中加入1mL PBS-Tween20洗液，转动磁板架3次以上，洗涤免疫磁珠混合物。重复上述步骤2.42.6。,重复上述步骤2.42.5 注意:洗涤共3次，动作要轻柔。吸取上清液至磁珠聚集物处时，应放慢速 度。上清液的吸取应尽量完全。使用多块磁珠分离装置时，磁铁与磁铁应 远离放置。免疫磁珠悬浮：移走磁板，将免疫磁珠重新悬浮在100L PBS-Tween20洗液中。,涂布平板 用漩涡混合器将免疫磁珠混匀，用加样器各取50L免疫磁珠悬液分别转移至CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157显色琼脂平板一侧，然后用涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半，再
13、用接种环划线接种平板的另一半。待琼脂表面水分完全吸收后，翻转平板，于361培养1824h。注意，若CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157显色琼脂平板表面水分过多时，应在37下干燥1020min，涂布时避免将免疫磁珠涂布到平板的边缘。,大肠杆菌在选择性琼脂平板上的菌落特征,大肠杆菌在MAC上,生化反应,从鉴别平板上挑取5个可疑菌落，分别接种KIA或TSI，靛基质试纸片，37培养18-24h。凡分解乳糖、蔗糖产酸，葡萄糖产酸并多数产气，H2S阴性，靛基质阳性的菌株，可鉴定为大肠杆菌。如果靛基质阴性，且V-P试验阴性，在西蒙式枸橼酸盐琼脂上不生长，才可证实为大肠杆菌。肠侵袭性大肠杆菌常
14、不分解乳糖。,血清学试验,挑取生化反应符合的菌落与大肠杆菌多价血清作玻片凝集试验，阳性者再以该多价血清包含的单价血清进一步鉴定。并作盐水对照。,EPEC诊断血清包含三组多价血清及相应的单价血清多价1：O55、O86、O111、O127多价2：O26、O125、O126、O128多价3：O44、O112、O119、O124EIEC诊断血清包含两组多价血清及相应的单价血清多价1：O28、O29、O112、O124多价2：O136、O143、O144、O152、O164大肠杆菌诊断血清包含七组多价血清及相应的单价血清，可供EPEC、EIEC、ETEC的诊断用多价1：O86、O111、O127多价2：O26、O44、O114、O126、O142多价3：O55、O119、O125、O146多价4：O6、O8、O20、O25多价5：O1、O27、O78、O128、O148、O149多价6：O28、O112、O124、O136、O143、O144多价7：O63、O152、O158、O159 其中，多价1，2，3包含EPEC的O因子；多价4，5包含ETEC的O因 子；多价6包含EIEC的O因子。,谢 谢！,
