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1、荧光介绍及荧光显微镜的使用,Leica 图象分析仪,组成部分,显微镜 荧光显微镜 可见光显微镜成象系统 照相机 图象采集软件,一、荧光显微镜的使用,优点：检出能力高对细胞的刺激小能进行多重染色用途：物体构造的观察荧光的有无、色调比较进行物质判别发荧光量的测定对物质定性、定量分析,物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。一种光化荧光,什么是荧光?,荧光的种类,自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光二次荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光,自发荧光 二次荧光,荧光的性质,吸收光保持固有的荧光特性荧光波长激发波长荧光强度极小于
2、激发光的强度有不同程度的衰减荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率,荧光显微镜的种类 透射式 落射式,荧光显微镜的主要部件,落射式汞灯光源激发滤色镜分色镜吸收滤色镜,透射式汞灯光源激发滤色镜暗场聚光镜吸收滤色镜,落射荧光显微镜原理,汞 灯,激发滤色镜,分色镜,吸收滤色镜,物 镜,标 本,透射荧光显微镜原理,目镜,吸收滤色镜,物镜,暗场聚光镜,激发滤色镜,汞灯,荧光激发滤色块,透过能使标本产生荧光的特定波长的光，同时阻挡对激发荧光无关的光。,几种主要的荧光激发滤色块,荧光显微镜标本制作要求,（一）载玻片载玻片厚度应在0.81.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在
3、标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。（二）盖玻片盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。（三）标本组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。（四）封裱剂封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.59.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.09.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。（五）镜油一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替。,单细胞悬液制备,制胶片,DNA
4、碱解旋,电泳,中和,细胞裂解,染色与观察,单细胞凝胶电泳试验（彗星试验）,对照组与实验组中肺泡巨噬细胞DNA迁移的实验图象,DAPI+FITC+Texas Red,二、可见光显微镜的使用,光源在显微镜下方，不需要开汞灯可以观察载玻片上的任何物质,三、成象系统,1、照相机2、图象采集软件 Leica100图象分析软件，把显微镜下看到的图象拍摄下来，保存成图片文件，再进行相关分析。,使用要点,标本制作正确选择滤色镜200W的超高压汞灯作光源，需预热15分。寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。防止污染（载物台已被EB污染）染色后尽快观察，荧光逐渐减弱,测试题,1、该仪器由哪几部分组成？2、什么是荧光？荧光有几种类型？有什么性 质？3、该仪器的使用要点有哪些？4、荧光显微镜分哪两种？,谢谢大家！欢迎提出宝贵意见！,
