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1、荧光光度法测定样品中核黄素的含量,基础化学实验（仪器分析实验）,化学国家级实验教学示范中心,Northwest University,日立F-4500荧光分光光度计的使用（第一次训练）荧光激发光谱和发射光谱的制作（第一次训练）工作曲线法（巩固训练）,实验技能训练要点,一、实验目的二、实验原理三、实验步骤四、结果处理五、思考题六、实验延伸,一、实验目的,学习荧光分光光度法测定样品中维生素B2的分析原理。掌握日立F-4500荧光分光光度计的使用方法，并了解此仪器的主要构造。了解分子荧光产生的机理。,常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发
2、态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。,二、实验原理,激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线,激发光谱,发射光谱,固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。,在稀溶液中，荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系：当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的
3、浓度成线性关系：这是荧光光谱法定量分析的理论依据。,IF-荧光强度F-荧光量子产率,b-吸收光程-摩尔吸光系数C-荧光物质浓度,a.与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。b.选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。c.所需试样量少、操作方法简便。,常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示：,荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：a.荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；b.荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光干扰。,光源的要求：,发射强度足够且稳定的连续光谱光辐射
4、强度随波长的变化小有足够长的使用寿命,常用气体放电灯类型：氙灯光源 高压汞光源,氙灯,光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。,原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光.,单色器,检测器,光电倍增管,样品池：四面透光，石英玻璃制,1.样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样,2.吸收池的形状：紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光 荧光分光光度计的样品池四面透光,波长范围,3.使用注意事项,容易破碎,问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？,沾污问题,维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状
5、结晶，其结构式为：维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，用氯仿萃取后可进行荧光测定。但通常采用简化的方法测定维生素B2。溶液在420450 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为525 nm。VB2的荧光在pH=67时最强，在pH=11时消失。故测VB2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。,核黄素(VB2),光黄素,1日立F-4500型荧光光度计及其附件。2容量瓶：50 mL。3维生素B2标准贮备液（20gmL-1）：准确称取20mg维生素B2，用1/10(v/v)的醋酸定容至1000mL容量瓶中，保存于冰箱中。醋酸：
6、1/10(v/v)。,仪器与试剂,1绘制工作曲线 准确移取维生素B2标准溶液液0，0.50，1.50，2.50，3.50和5.00 mL，分别加入6个50 mL容量瓶中，用去离子水定容，摇匀，其浓度分别为0，0.20，0.60，1.00，1.40，2.00gmL-1。,三、实验步骤,2样品的准备 准确称取粉碎后的核黄素样品0.10.2g，用30mL1/10(v/v)醋酸溶解，必要时低温加热使其溶解完全，然后用水定容至100mL。由于样品中存在辅助的添加剂，如淀粉，使溶液浑浊，不利于荧光测定，所以需要对其进行干过滤，过滤后，准确移取滤液0.50mL于50mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度。,3维
7、生素B2的激发光谱和发射光谱的绘制 激发光谱的制作:按仪器的使用方法准备好仪器。待仪器稳定后，将2.00gmL-1的维生素B2标准溶液润洗样品池，然后装入溶液，放入仪器中，首先固定荧光的发射波长（400nm600nm），然后扫描激发光波长，以所测得的该发射波长下的荧光强度对激发光波长作图，即可得到荧光化合物的激发光谱，从光谱中可以得到最大激发波长。,发射光谱的制作 固定荧光的激发波长为，扫描发射单色器，然后记录发射荧光强度，以所测得的各波长荧光强度对发射波长作图，即可得发射光谱，从光谱中可以得到最大发射波长,以 为激发波长，以 为荧光发射波长，分别测定标准系列溶液和样品溶液的荧光强度。,4标准
8、系列与样品溶液的测定,1列表记录各项实验数据。2以荧光强度为纵坐标，标准系列溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。3根据样品溶液的荧光强度，在标准曲线上查得对应的浓度Cx，然后计算样品中维生素B2的百分含量。,四、数据处理,1激发波长与荧光波长有何关系？为什么？2测定过程中应注意哪些问题？,五、思考题,六、实验延伸,1、蛋白质是生物大分子，它能在溶液中与某些染料静电吸引或氢键结合，可用紫外可见光度法或荧光测定蛋白质。蛋白质的荧光，主要是构成它的色氨酸，络氨酸和苯丙氨酸具有的荧光，通过蛋白质的天然荧光用荧光法检测比紫外吸收法灵敏。荧光探针是一类比蛋白质荧光发射较强荧光的染料，它吸附或共价结合到蛋白质上，荧光特性会发生变化，从而可以利用荧光分析研究蛋白质的结构和测定蛋白质。2、探讨蛋白质的激发光谱和发射光谱。,参考文献,1、杨建男 徐大庆 马勇 FIA荧光光度法测定粮食中的核黄素。分析仪器1990，V04，p11.2、荧光分析原理(影印)（美）拉科维兹 编著，科学出版社 2008年03月第三版3、仪器分析教程叶宪曾，张新祥 等编著，北京大学出版社2007年01月第2版,
