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1、荧光分析法测定维生素 C,维生素 C及维生素C 的测定原理,荧光分析法测定维生素 C实验,荧光分析法测定维生素 C 应用,讲解人：贺政轩,一、维生素 C及维生素的测定原理,1.1维生素C 维生素 C 又名抗坏血酸,是维持机体正常生理 功能的重要维生素之一,而人体不能自身合成，只能 从食物和药物中摄取，因此，食品、药物中维生素 C 的分析具有重要意义。,1.2维生素C测定方法 维生素 C 的测定常用的方法有光度法、电化学法、滴定法、酶法、色谱法等。本实验提出了一种新的测定维生素 C 的荧光 分析方法：维生素 C 被 Cu2+氧化为脱氢 抗坏血酸，再与苯甲酸及十六烷基三甲基溴化铵产生荧光协同增敏作
2、用，通过对体系荧光强度的测定进行维生素 C 的定量分析。,二、荧光分析法测定维生素 C实验,1实验1.1 主要仪器与试剂 分子发光仪:LS-55 型 酸度计:pH-211型 榨汁机:CW-JE04型 电热恒温水浴锅:HH.SY11-N i1型 CuSO4溶液:2.0 10-3 g m/L 十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)溶液:6.0 10-4 g/mL 苯甲酸溶液：1.0 10-4 g m/L 维生素 C 标准储备液:5.0 10-4 g/mL,2 8（避光保存）；维生素 C 标准溶液:1.0 10-5 g/mL,2 8（避光保存）；NaOH-邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液:pH=6.0；,1.2
3、实验步骤（1）配置待测样品及空白对照 在 25 mL 比色管中依次加入 0.6 m L CuSO4 溶液，2.0 m L十六烷基三甲基溴化铵溶液，2.0 m L 苯 甲酸溶液，一定体积的维生素 C 标准溶液，5.0 mL NaOH-邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液,用蒸馏水定容，摇匀；以不含维生素 C 溶液为 空白对照。（2）水浴加热 在 35恒温水浴中加热 30 m in，将溶液流水 冷却至室温。（3）荧光分析 将待测样品放置于样品架上，设定激发波长为 308 nm，发射波长为 408 nm，测量荧光强度 F，以不含维生素 C 的试剂空白为 F0，计算 F测=F-F0。,2 结果与讨论2.1 激发光谱
4、和发射光谱取 3.0 mL 维生素 C 标准溶液,按实验方法进 行操作,分别在 290 330 nm、360 460 nm 内扫描 得到激发光谱和发射光谱如图 1、图 2所示。从图 1、图 2中可看出,当激发波长为 308 nm,发射波长 为 408 nm 时体系的荧光强度最大,试剂空白的荧光 值比较低且稳定,故本实验选择激发波长为 308 nm,发射波长为 408 nm。,1 C u2+BA+缓冲溶液+CTMAB;2 Cu2+BA+维生素 C+缓冲溶液+CTMAB,1 C u2+BA+缓冲溶液+CTMAB;2 Cu2+BA+维生素 C+缓冲溶液+CTMAB,激发光谱,发射光谱,2.2 试剂加
5、入顺序按照实验方法操作,在各试剂加入量相同的情况下,试验了试剂的不同加入顺序对荧光强度的影 响。试验结果表明,当所加试剂顺序依次为 CuSO4 溶液、苯甲酸溶液、维生素 C 标准溶液、NaOH-邻 苯二甲酸氢钾缓冲溶液时,体系的荧光强度最大，因此选用此加入顺序为最佳试剂加入顺序。,2.3 缓冲溶液 溶液的pH值对体系荧光强度有较大的影响，试验了不同的pH值对荧光强度的影响。由pH值 荧光强度的曲线可知,当 pH 值为 5.9 6.2 时,荧光强度达到最大值且比较稳定,因此确定最佳 pH 值为 6.0。缓冲溶液的种类对体系的荧光强度也有一定的影响。试验了以下几种 pH 值为 6.0 的缓冲溶液:
6、NaOH-KH 2 PO4、KH2 PO4-硼砂、KH2 PO4-Na2 H PO4、NaOH-邻苯二甲酸氢钾、Na2 H PO4-柠檬 酸、NaOH-柠檬酸钠、HA c-NaA c等。试验结果表明,当所加的缓冲溶液为NaOH-邻苯二甲酸氢钾时,荧光强度最大且稳定。因此本实验选择NaOH-邻苯二甲酸氢钾为缓冲溶液,其最佳用量为 5.0 m L。2.4 加热温度和加热时间 试验了不同温度对体系荧光强度的影响。结果表明,当加热温度为 35时，既有利于提高体系反应速度，又不使反应物与产物结构受到破坏。改变 加热时间进行试验,结果发现，在 35水浴中加热30 m in，体系荧光强度达到最大值且相对稳定
7、。,2.5 硫酸铜和苯甲酸的用量其它条件不变，试验了硫酸铜和苯甲酸的用量对体系荧光强度的影响。结果表明，当硫酸铜的用量为 0.6 m L、苯甲酸的用量为 2.0 mL 时，体系荧光强度最大。2.6 表面活性剂 分别试验了十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)、十二烷基磺酸钠及-环糊精对体系荧光强度的影响。结果表明,表面活性剂对体系的荧光强度有一定的增敏效果，其中 CTMAB 对体系的增敏效果最 好。进一步试验了 CTMAB 的用量对体系的荧光强度的影响,当 CTMAB 的用量为 2.0 m L 时,体系荧光强度最大。,三、荧光分析法测定维生素 C 应用,样品测定 取一片维生素C药片，研细，混匀，准
8、确称取 0.152 0 g 溶于二次蒸馏水中，转移至 500 mL 容量 瓶中定容，配成水溶液。再准确移取10 m L此溶液，将其稀释成 100 m L的溶液，作为样品稀释液。对样品稀释液进行测定并做加标回收试验。同时利用本法对西红柿和果珍进行测定。准确称取一定量的果珍，将其配成100 mL的溶液。将清洗干净的西红柿榨汁，称取一定量的西红柿汁，将其配成100 m L的溶液。其它步骤和维生素 C 药片的测定方法 相同。,样品测定结果列于表 3表 3 样品测定结果(n=3)。由表3可知，用荧光分析法测定维生素C药片、西红柿和果珍中维生素C的含量，回收率为96.7%100.5%准确度较高。,表 3
9、样品测定结果(n=3),荧光分析法测定维生素 C 具有操作简单,精密 度高,检出限低等优点,该法可以应用于水果、蔬菜 和药物中维生素 C 的检测,适于推广。,谢谢观赏！,The end,利用某些物质受光照射时所发生的荧光特性和强度，进行物质的定性分析或定量分析的方法，称为荧光光谱分析。,使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所发生的荧光通过发射单色器照射于检测器上，调节发射单色器至各种不同波长处,由检测器测出相应的荧光强度，然后以荧光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，即为荧光光谱，又称荧光发射光谱。荧光发射光谱反映物质下能级的信息。让不同波长的激发光激发荧光物质使之发生荧光，而让荧光以固定的发射波长照射到检测器上，然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标，所绘制的图即为荧光激发光谱，又称激发光谱。,1.2荧光光谱分析法,
