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1、实时荧光定量PCR技术的原理、应用及实践,(Real time Quantitative PCR),Real time Quantitative PCR,基 本 原 理,Company name,基本原理,Company name,Real-time qPCR的定义,Company name,实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析。,Real-time PCR仪 ABI7500,PCR：基本原理,Denaturation:94 96C,Annealing:50 65C,Extension:70
2、75C,基本要素：Template Primers DNA polymerase dNTP,N=A,G,C or T,Company name,与普通PCR的比较,S形曲线，具有平台效应,终点检测法,反应效率差异的累积使终点定量几乎不可能,不同浓度的起始模板经PCR扩增后到达某一定值时所需要的循环数来计算起始模板量,定量原理,Company name,理想的PCR反应：X=X0*2n实际的PCR反应：X=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率,定量原理,在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增
3、信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:log M=log X0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:log X0=-log(1+Ex)Ct+log M(3)log(1+Ex)Ct=-log X0+log M Ct=-klogX0+b,Company name,Company name,每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT 值越小。,确定初始模板的浓度,定量原理,Ct=-klogX0+b,real-time qPCR使确定模板初始数量成为可能,11,实时荧光定量PCR中的三个概念,扩
4、增曲线(primary curve),Company name,Company name,荧光阈值（threshold),是在扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在PCR反应指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍。,阈值线,原则：1）要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；2）同时要尽量选择进入指数期的最初阶段,CT 值(Cycle Threshold),Company name,Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,Company name,Ct值的特点：相同模板进行96次
5、扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性,检测方法,Company name,非特异性荧光标记：SYBR Green I特异性荧光标记：水解探针：TaqMan非水解探针：Molecular beacon,17,解析方法,Company name,将温度对荧光强度的变化求导。(-dI/dT),确认PCR反应的特异性,融解曲线分析,Company name,融解曲线分析,Company name,初始模板量的对数与循环数（Ct值）呈线性关系，就可以制作以起始拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标的标准曲线。,标准曲线分析,计算样品的起始拷贝数,已知基因拷贝数的标准品建立标准曲线,关键：DNA的精
6、确定量,绝对定量,22,相对定量,以各自样本中内参基因为标准，比较不同样本中目的基因的相对表达丰度,23,相对定量的数据处理,Ct,Ct,Pfaffl Modification,Vandesompele Method,非均一化的需要后续的均一化,以内参基因作为标准目标样品的相对定量通过内参基因的相对定量进行均一化只有一个内参基因假设扩增效率为100%,扩增效率不同只有一个内参基因,扩增效率不同多个内参基因,简单,复杂,比较Ct法 2-CtFold induction=23=8,Company name,相对定量方法,Ct存在的问题,Company name,成立条件：假设扩增效率为100%满足
7、条件：1）内参基因和目标基因的扩增效率接近 2）内参基因和目标基因的扩增效率为90%-110%,相对定量方法,实 验 流 程,Company name,应 用,定量 基因表达水平检测定量 基因拷贝数检测多色标记 SNP检测高精度溶解曲线分析（HRM）-SNP高精度溶解曲线分析（HRM）-DNA甲基化分析,基因表达水平检测,Company name,样本处理,RNA提取,qPCR,数据分析,实 验 流 程,逆转录,样本处理与RNA提取,外界刺激 可检测的表达改变样品离开定义环境 裂解、固定细胞Trizon 裂解液（氰酸胍，异硫氰酸呱，SDS）液氮RNA保存液 小心DNA污染！使用DNase 以R
8、NA作PCR阴性对照,CW0580,CW0592,逆转录,逆转录引物选择下游应用：是否检测其它基因？Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？检测灵敏度是否足够？是否会有二级结构干扰？,一步法还是两步法？,两步法：步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留检 测多个基因。便于反应优化。推荐：工作的初期阶段,RealSYBR 二步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX,RealSYBR 一步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX,RealSuper 二步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX,一步法：简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找原因。推荐：工作的成熟阶段
9、,RealSuper 一步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX,Master mix的优化,Hotstar化学修饰，低温下酶活抑制强，热复活需10分钟Fast Hotstar抗体或oligo修饰，热复活仅需几十秒,CW0696,CW0704,热启动DNA聚合酶,反应条件优化,内参基因单一特异性产物反应效率90%-110%,反应条件优化,目的基因单一特异性产物反应效率接近内参基因反应效率尽量高,内参基因,高丰度 ACTB，GAPDH中等丰度 beta2M低丰度 HPRT1,36,扩增产物设计原则,总原则与普通PCR相同,二级结构,Company name,扩增产物的二级结构,引物避免位于颈环
10、结构上,Company name,引物的位置,Company name,55,60,65,温度对二级结构的影响,Company name,实 践,Company name,实 践,内参基因的标准曲线的绘制与数据分析,Company name,样本：293T细胞株 人提取方法：Trizon RNA 提取试剂,CWBIO 公司 CW0580说明书,2106 个细胞总RNA 琼脂糖凝胶电泳图,RNA提取,Company name,逆转录：HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒,CWBIO 公司 CW0744说明书,取5ul扩增产物，用1.7%琼脂糖凝胶进行电泳,体系：2 TaqMasterMi
11、x 10ulGAPDHF引物（10um）0.5ulGAPDHR引物（10um）0.5ulcDNA 1u加入灭菌水至20 ul。,逆转录,Company name,模板,反应体系的配置,cDNA 模板 2.0l正向引物F(10M)0.5l反向引物R(10M）0.5lREALSYBR Mixture(2)10.0lddH2O 7.0lTotal 20.0l,Company name,注意：1、为了避免加样误差，做预混体系 2、充分混匀，如有气泡短暂离心,Company name,95 5min95 10-15sec60 20-30secPlate readGo to 2 for 39 cycles moreMelting curve analysis:from 72 to 95,read every 0.2,hold 1sec between reads End,Tm值：DNA解链一半时的温度,将荧光强度的变化对温度求导：-dI/dT,Tm,-dI/dT(max),反应条件的设定,Company name,常规考虑：避免实验操作的污染。戴手套 空白对照:监测污染(假阳性)设反应重复（一般至少二个）保证重复性好：配制反应预混合液，避免取样误差,实验操作注意事项,Real time PCR 的实验技术应用讨论,Company name,实 验 操 作,
