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1、PCR扩增的理论模式Real time PCR理论基础,PCR是将样本中微量的DNA模版放大来研究模版特性。随着研究的深入，要了解样本中基因的表达模式与疾病的关系，就需要了解标本中的DNA原始拷贝数。,由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时间和平台期的高低都有很大变化，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也往往不同。因此经过PCR扩增的DNA产物量不能反映起始模板量的真实情况。通过凝胶电泳EB染色或者同位素标记只能定量PCR的终产物量，而不能定量起始DNA模版的拷贝数。,实时荧光定量PCR,实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基
2、团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高，特异性和可靠性强，重复性好，自动化程度高、无污染性等突出优势，因此被公认为当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术。,PCR扩增的理论模式,PCR中，随着扩增周期的增加，模板以指数方式进行扩增。PCR 理论方程：N=N0(1+E)nN:扩增子数量N0:起始模板数量E：扩增效率n:循环数此公式仅在指数扩增期（20-30个循环）内成立。,PCR分期“S”形曲线,对 PCR 扩增过程的详细分析表明，PCR 扩增曲线可被分为三个典型时期：早期背
3、景扩增期、中期指数扩增期（或对数线形扩增期），以及晚期的平台期,理论上PCR过程中反应产物是以指数规模增长的，但实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线；因为随着PCR循环数的增加，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率降低，产物生成的速度逐渐减缓，最终进入平台期。,两种定量方法,两种定量方法,起始DNA量，更具意义重现性好，误差小扩增效率恒定，标准曲线呈线性,普通PCR技术的检测模式,普通PCR仪器扩增，约2.5小时,琼脂糖凝胶电泳，约1小时,EB染色，约20分钟紫外成像,阴性,阳性,样品检测结果,无法定量,实时荧光
4、定量PCR的检测模式,荧光定量PCR仪器扩增，约2小时,检测过程有实时监测数据,光滑的S型指数曲线，阳性,无S型指数曲线，阴性,实时荧光定量PCR的检测模式,需绝对定量时,四个已知浓度的标准品，得到标准曲线,系统即可自动计算出未知样品的浓度,阴性结果曲线图示,阳性结果曲线图示,实时荧光定量PCR基本原理,在常规PCR反应的基础上，加入荧光染料或荧光标记的探针，随着PCR反应的进行，PCR产物不段累积，荧光信号强度等比增强。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而对起始模板定
5、量及定性的分析。,荧光扩增曲线分三阶段,荧光背景信号，荧光信号指数扩增阶段，平台期荧光背景信号阶段：该时期扩增的荧光信号被背景信号所掩盖，扩增产物量无法判断。平台期：扩增产物不再呈指数增加，PCR终产物量与起始模板量无线性关系，无法计算起始DNA拷贝数。荧光信号指数扩增阶段：该时期，PCR产物量的对数值与起始模板量呈线性关系，因此选择这一阶段进行定量分析。引入两个概念：荧光阈值和Ct值。,实时定量PCR的两个重要概念,（1）荧光域值（threshold）：荧光扩增曲线上人为设定一个值，以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的1
6、0倍。阈值=基线信号的标准偏差 x 10,实时定量PCR的两个重要概念,(2)Ct值：也称循环阈值，C代表Cycle，t代表threshold。指在PCR循环过程中荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。在实际操作中，Ct值也就是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值的循环次数,可见Ct值取决于阈值。,基线 阈值 Ct值,Ct值DNA起始浓度,Ct值与模板DNA的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始拷贝数越多，达到荧光阈值的Ct值越小。Rn=RB+X0(1+E)n Rs总信号=本底信号+分子数量单位信号强度Rn：第n个循环时的总信号RB：本底RS：单位信号强度X0：起始DNA数目
7、E：PCR效率,Rn=RB+X0(1+E)n Rs 当循环次数n=CT值时：RT=RB+X0(1+E)CTRs lg(RT-RB)=lg X0+CT lg(1+E)+lg Rs CTlg(1+E)=-lg X0+lg(RT-RB)lg Rs即 CT=-k lg X0+b（线性方程）,定量方法,利用已知起始拷贝数的标准品做出标准曲线，纵坐标代表起始拷贝数的对数，横坐标代表Ct值。所以，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,Real time PCR 化学原理,双链DNA结合染料染色-非特异性检测 SYBR Green I 溴乙锭(Ethidium Bromide)
8、探针标记-特异性检测 TaqManTM TaqMan MGB Dual-oligo FRET pairs 分子信标(Molecular beacons)ScorpionsTM/AmplifluorTM,SYBRGreenI荧光染料的作用原理,SYBRGreenI是一种只与双链DNA小沟结合的荧光染料，可与所有的各种序列的双链 DNA 分子结合。当它与DNA双链结合时，发出荧光；变性时，DNA双链分开时，荧光信号急剧减弱。在延伸结束阶段，采集荧光信号。因此，在一个体系内，信号强度与DNA双链总数目成正比其信号强度代表了双链DNA分子的数量。,退火：产生荧光信号,结合SYBR Green I,SY
9、BR Green I 染料仅在与双链 DNA（dsDNA）结合时发射荧光，所发射的光波是蓝色光。SYBR Green I 不会与单链 DNA 结合，因此变性时荧光强度最低。dsDNA形成单链（图 A）合成双链（图 B）时，SYBR Green I 结合于dsDNA上，结合的 SYBR Green I（绿色光）的荧光信号强度增强。延伸末期（图 C）时，所有 DNA 均是双链，结合状态的SYBR Green I 含量达最大，该 PCR 周期中荧光信号也达最大。因此，通常是在延伸期结束时进行 SYBR Green I 荧光信号测定。,染料法优缺点,荧光共振能量转移（FRET）,当某个荧光基团的发射谱
10、与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET)，实际相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽。Hybprobe探针和水解探针均基于 FRET（荧光共振能量传递）的原理设计的。,TaqMan探针法-水解探针,PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。TaqMan探针为一寡核苷酸，包含两个分子标记，探针的5端标记有荧光报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等，3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q
11、)，如TAMRA等。,探针完整时，报告基团发射的荧光信号被近距离的淬灭基团吸收；随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，游离于反应体系中，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。,TaqMan探针的数量关系,每扩增一条DNA链，就切断一条探针；每切断一条探针，就产生一个单位荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步；信号强度与结合探针的DNA分子数成正比，报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。因此该技术可对模板进行准确定量。由于扩增产物较短时效率较高，故扩增长度一般为50150bp。,TaqMan
12、探针的优点,特异性高多重基因定量荧光强度正比于产物不可逆反应 信号生成后不会自动淬灭,Real time PCR优点,对整个PCR实时监控，明确了指数扩增期，进而可对起始模板进行定量，且定量范围广；测定敏感性高，比电泳方法的灵敏度高2-3个数量级；测定准确度和重复性好，Ct值和模板起始浓度有函数关系；大大降低实验室“污染”的可能性。无需后续处理产物，可分样本处理区，加样去，检测区三区即可。,定性检测（A或B？有或无？是什么？）特定病原的检测疾病的诊断GMO检测基因分型（如SNP、耐药性检测）辨别真伪的检测定量分析(有多少？差几倍？）绝对定量病原载量的定量GMO成分的评估残留DNA的测定相对定量基因表达差异的比较治疗手段的效果评估,实时荧光定量PCR技术的应用,
