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1、荧光分光光度法测定药片中维生素B2的含量,授课单位：化学与生命科学学院授课课程名称：仪器分析实验教 师：陈志兵,荧光分光光度法测定药片中维生素B2的含量,实验目的,学习荧光分光光度法测定药片中维生素B2的分析原理。掌握荧光分光光度计的操作技术和测定药片中维生素B2 的方法。掌握Origin绘图软件的使用方法,实验原理,常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。,实验原理,在稀溶液中，荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系：当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质
2、的浓度成线性关系：这是荧光光谱法定量分析的理论依据。,a.与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。b.选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。c.所需试样量少、操作方法简便。,激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与激发光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。,激发光谱,发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择
3、是本实验的关键。,发射光谱,常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示：,荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：a.荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；b.荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光干扰。,a.光源：在荧光计中常用卤钨灯作光源；荧光分度计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源。b.单色器：荧光计的单色器是滤光片，只能用于定量分析；荧光分光光度计采用两个光栅单色器，可获得激发光谱和荧光光谱。c.检测器：荧光计采用光电管作检测器；荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器。,仪器部件,维生素B2（又叫核黄素，V
4、B2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。,维生素B2溶液在430480 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为525 nm。VB2的荧光在pH=67时最强，在pH=11时消失。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测VB2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。,光黄素,实验预习,预习荧光分光光度法测定维生素B2的分析原理。了解荧光光度计的操作步骤和测定维生素B2 的方法。,F-4500型荧光光度计（日本日立公司）10mL具赛试管1
5、0只，移液枪1只，100 mL容量瓶2只510-5gmL-1 VB2标准溶液（置阴暗处保存），冰乙酸（AR），药用VB2试样(510-4gmL-1),仪器与试剂,1.打开计算机，先接通电源开关（POWER），5秒钟后再按下Xe LAMP按钮，再接通主开关（MAIN），此时主开关上方绿色指示灯连续闪动三下，然后打开操作软件。2.仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：激发波长，发射波长。3.样品测定。4.关机顺序：逆开机顺序实施操作。,基本操作,1.标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定：在10个干净的10 mL具赛试管中，分别吸取25、50、75，100、125、1
6、50、175、200uL VB2标准溶液，用石英亚沸水稀释至刻度，摇匀。从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。,实验步骤,2.未知试样的测定:在两支10 mL具赛试管中，分别移取100 uL试样,用石英亚沸水稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，测量其荧光强度。,实验步骤,1.用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。2.根据待测液的平均荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中VB2含量。,数据处理,1.解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。2.维生素B2在pH67时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？,注意事项和问题,1、波长扫描（Wavelength Scan）对样品
7、进行激发波长或发射波长的扫描。点击快捷栏“Method”,显示出“Analysis Method”的五个命令，分别为 General(常规)、Instrument(仪器条件)、Monitor(模拟监测)、processing(处理方法)、Report(报告格式)，输入相应数据。,附录：仪器操作软件有关说明,1.1 General Measurement-选择Wavelength 1.2 Instrument Scan mode-输入扫描方式 Data mode-输入数据采集方式 EM WL-输入发射波长 EX Start WL-输入激发起始波长 EX End WL-输入激发终止波长 EX WL
8、-输入激发波长 EM Start WL-输入发射起始波长 EM End WL-输入发射终止波长,附录：仪器操作软件有关说明,Scan speed-扫描速度选择 Delay-延迟时间 EX Slit-激发单元狭缝 EM Slit-发射单元狭缝 PMT Voltage-光电管负高压 Response-响应速度 Corrected spectra-光谱校正 Shutter control-光闸控制 Replicates-重复次数 Cycle time-循环周期,附录：仪器操作软件有关说明,1.3 Monitor Y-Axis Max-纵轴标尺上限值 Y-Axis Min-纵轴标尺下限值2、时间扫描（
9、Time Scan）此扫描方式是EX,EM的波长均固定，仅观察样品随时间的变化。模拟画面的横坐标为时间单位，进入方法与波长扫描相同。2.1 General Measurement-选择Time Scan 2.2 Instrument Data mode-数据采集方式 EXWL-设定激发波长 EMWL-设定发射波长 Time unit-时间单位 Scan time-扫描周期,附录：仪器操作软件有关说明,2.3 其它与波长扫描相同，从略。3、光度法（Photometry）也称工作曲线法，是定量测量方法。有六个子命令，分别为General、Quantitation、Instrument、Standards、Monitor、Report,输入相应测量条件后进行测量。3.1 General Measurement-选择Photometry,附录：仪器操作软件有关说明,3.2 Quantitation Quantitation type-选测量类型 Calibration type-校正曲线类型3.3 Instrument 3.4 standards4、三维扫描（3-D SCAN）当某个样品不知最佳激发波长和最佳发射波长时，利用该功能，可自动快速地给出最佳条件。4.1 General-选择3-D Scan方式。4.2 其它子命令选择方式同前。,附录：仪器操作软件有关说明,
