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1、荧光素&流式细胞术,杨 培,荧光素介绍 流式细胞术基本原理 流式细胞术的应用 流式胞内因子的流式检测 流式多色Panel设计,主 要 内 容,一.荧光素介绍,荧光素（Fluorescein）是具有光致荧光特性的染料，荧光染料种类很多。荧光染料泛指吸收某一波长的光波后能发射出另一波长大于吸收光的光波的物质。它们大多是含有苯环或杂环并带有共轭双键的化合物。,荧光素介绍,荧光素的激发和发射光谱,任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱（nm）激发光谱（Excitation，Ex）：是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Max发射光谱（Em
2、ission）：是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光发射波峰（最大发射波长）：Em-Max荧光素的使用：选择正确的激光器确定所需荧光探测器（PMT）,荧光素介绍,Blue（488nm）FITCAlexa Fluor 488PEPerCPPerCP-Cy5.5PE-Cy5PE-Cy7PI7-AADRed（633nm）APCAPC-Cy7AF647AF700,Violet（405nm）AmCyanBrilliant Violet 421Pacific BlueBrilliant Violet 510Brilliant Violet 570Brilliant Violet 605B
3、rilliant Violet 650Brilliant Violet 711Brilliant Violet 785Qdot 605UV(360nm）DAPI,常用荧光素,荧光素介绍,第二步：荧光素的选择,荧光素光谱分析网络工具：,荧光素介绍,合成的有机物Alexa Fluors,Cy dyes,Horizon,Dylight,etc,蛋白 PE,APC,GFP,mCherry,半导体纳米 Qdots,Crystalplex,eFluorNC,有机聚合物Brilliant Violet,PE,Cy5,Cy5,Cy5,荧光素家族,Collisional Quenching,荧光素淬灭,耦合荧光
4、素,耦合荧光素,anti-Mouse CD3e,clone 145-2C11-PE/Cy5,BioLegend,Competitor 1,耦合荧光素不同厂家，抗体荧光强度不同：F:P值不同 耦合荧光素对光、对固定剂更敏感,Brilliant Violet TM 570Brilliant Violet TM 605Brilliant Violet TM 650Brilliant Violet TM 711Brilliant Violet TM 785,耦合荧光素家族,PE-Cy7,Brilliant Violent TM简称“BV”，是诺贝尔奖获得者发明的“最新一代”的荧光染料，“BV”染料是有
5、机聚合物，它有很强的光吸收能力（消光系数）和光转换能力（量子产率），这些物理特性使“BV”的亮度很强，更适合弱表达蛋白的检测。Brilliant Violent TM荧光素家族，包括：BV421，BV510,BV570，BV605，BV650，BV711，BV785 七个成员，充分利用流式细胞仪405nm激发管，与其它各种荧光素兼容性好。Biolegend公司可以提供最新最全的BV系列荧光抗体，BD 目前只推出了四种！,Brilliant Violet TM荧光素家族,荧光强度。（检测灵敏度及联接蛋白数量）吸收光谱宽窄。（多色染色时不易漏光）光稳定性。（光漂白）Buffer稳定性。（PH值稳
6、定）机器兼容性。（激发光与接收光是否与大众化的机器相匹配）,荧光素评价指标,不同荧光素发射波长及波长宽窄不同,荧光素评价指标-荧光发射波长,荧光素评价指标-荧光强弱,二.流式细胞术基本原理,流式细胞术（Flow Cytometry,简称FCM）是一种以流式细胞仪为检测手段，可以快速、准确、客观，同时检测单个生物微粒的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选。特点:研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、人工合成微球等 快速、准确、高通量检测 多参数、多色荧光分析，对细胞特性的识别、计数更为准确 定性或定量分析细胞 分选特定性状或功能的细胞,流式细胞术原理,液流系统光学系统
7、电子系统分选系统,流式细胞仪的基本结构,流式细胞仪-光学系统,前向角散射光（FSC）：反映相对大小侧向角散射光（SSC）：反映细胞粒度及细胞内相对复杂性,前向角检测器 FSC,Laser,激光光源,信号检测 散射光信号,外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）,根据散射光信号从人白细胞中鉴别出不同亚群：,信号检测 荧光素荧光信号,直方图(Histogram)二维点图(Dot Plot)三维图（3D Plot）等,直方图(Histogram),二维点图(Dot Plot),凋亡细胞峰,等高线图(Contour Plot)密度图(Density),流式数据,三维图（3D Plot）,流式细胞术
8、常用分析软件,BD cellquestBD FacsDiva。,仪器自带分析软件,第三方分析软件,三.流式细胞术的应用,流式技术的应用,流式技术的应用,流式检测技术：了解细胞的特征,细胞亚群细胞表型细胞粘附分子细胞因子受体细胞胞内因子细胞周期,四.流式胞内因子的流式检测,胞内检测(ICFC or ICS)?,胞内检测指标主要包括：细胞因子 胞浆 转录因子 细胞核 细胞内抗原 或 细胞内结构标志物 信号分子,如：活化的蛋白激酶,胞内流式检测操作,5.20,1.81,37.5,3.92,1.03,60.8,IL-17,IFN-,流式细胞因子检测,检测的细胞：是否分泌目标细胞因子 适合的细胞活化方法
9、分泌细胞因子的阻断：阻断剂的添加与选择固定，破膜：固定/破膜试剂的选择尽量选择强荧光素抗体检测死细胞的去除,细胞因子流式检测，需要考虑的因素：,细胞活化,细胞活化的一般方法：PMA/Ionomycin,PHA/ConA 模拟体内活化方法：MHC(抗原),TCR(CD3CD28),细胞因子(IL-2,IFN-r)，LPS,细胞活化的protocols：,分泌细胞因子的阻断,细胞因子表达后快速分泌，如果不进行阻断，则细胞内因子含量很低，无法检测.阻断剂包括:Brefeldin A(#420601)Monensin(#420701)阻断剂对细胞有一定毒性，与细胞接触的时间越短越好(2-24h)。,+
10、Brefeldin A,+Monensin,细胞的固定与破膜,固定:多聚甲醛(PFA)浓度,时间,温度(例如.2%PFA,4C,10-15 min)与荧光素，细胞表面指标兼容 终止液：staining buffer+BSA BioLegend Fixation Buffer(#420801)破膜:皂素(0.05-0.2%)其他破膜剂(MeOH,Tween 20,Triton X-100)后续步骤都需要破膜剂:洗涤步骤 抗体孵育 BioLegend Permeabilization Wash Buffer(#421002),胞内因子与细胞核内指标检测，需选择不同的固定破膜剂！,核内指标染色:Fo
11、xP3,T Reg 细胞鉴定：CD4+CD25+FoxP3+,BALB/c mouse splenocytes stained with Mouse Treg Flow Kit(FOXP3 Alexa Fluor 488/CD4 APC/CD25 PE),核内指标检测，需要破双层膜，固定/破膜剂不同于胞内指标使用的试剂！FOXP3 Fix/Perm Buffer(4x)(#421401)FOXP3 Perm Buffer(10 x)(#421402),如何节约您的时间？,胞内检测流程:需要大约1天,哪些步骤可以保存及暂停实验？,固定/破膜后染色检测需注意！,固定/破膜对表面指标的影响：,Kru
12、tzik et al.JI 2005,五.流式多色Panel设计,带有不同荧光素的细胞,针对细胞不同蛋白的标记 不同荧光素单克隆抗体,细胞与多种抗体共孵育,流式多色检测概述,更加准确区分某一特定细胞群 多种参数，获得更多信息 省时，省钱，省标本 有助于发更好的文章,流式多色检测的优势,Th1,需要功能强大的流式细胞仪 荧光素选择更加困难 补偿难调节,流式多色检测的难点,流式多色Panel设计,第一步：了解您的流式仪器配置 型号,激发光，探测器，滤光片第二步：荧光素与流式仪器相匹配第三步：检测指标与荧光素相匹配第四步：查找&订购商业的荧光素抗体,流式细胞仪主要厂商之一，分析分选均有，型号众多，科
13、研临床领域都涉及,流式细胞仪主要厂商之一，分析分选均有，型号众多，科研临床领域都涉及,分析型流式，科研临床领域都涉及,分析型流式，有几种型号，临床领域为主,Attune分析型流式，科研领域为主,分析型流式，科研领域为主,第一步：了解您的流式仪器配置,BD流式细胞仪,Canto and ARIA typical光路图,488 nm,405 nm,633 nm,BD Canto 光路参数,例 如：,BD Canto光路参数,第二步：荧光素与流式仪器相匹配,通常根据抗原的表达情况，可将其分为三大类：一类抗原：此类抗原高表达，且平行Panel中表达量变化不大.如：CD3,CD4,CD8,CD56,CD
14、11c等，通常选择弱荧光素：Pacific Blue,APC-Cy7,Alexa Fluor 700,BV785等 二类抗原：这类抗原是表型分型所必须的，平行Panel中表达量是变化的，如：活化的抗原，细胞因子等，通常选择中强荧光素：如：BV510，BV650，FITC,PerCP-Cy5.5，BV570等 三类抗原：抗原表达量非常低，或是我们根本不知道的抗原表达情况，而且通常仅能找到纯化抗体或是有限的几种荧光素标记。通常选 择最强的荧光素：BV421，PE，APC,BV605，Alexa Fluor 647等,第三步：检测抗原与荧光素相匹配,例如：Th1/Th2/Th17/Treg 检测 C
15、D3，CD4；IFN-r，Foxp3；CD25，IL-4,IL-17A,常用的荧光素强度,1.,弱表达抗原，一定选择最强的荧光素；如果您对所检测的抗原表达量不清楚，对于Panel内重要的抗原选择最强的荧光素；,人免疫细胞表面常用Marker的表达量,荧光素亮度不是选择的唯一标准,BD Canto 8色,耦合荧光素：如：Percp-Cy5.5,PE-Cy7，APC-Cy7等，对光及固定剂稳定性差：Percp-Cy5.5对乙醇固定敏感 APC-Cy7 对多聚甲醛固定敏感 耦合荧光素固定后，光谱可能发生改变2.FITC 对较低的PH敏感3.APC&PE不能冻存,例 如：,Th1/Th2/Th17/T
16、reg 检测,例 如：,仪器：BD Canto,检测指标：CD3，CD4，IFN-r，IL-4 Foxp3，CD25，IL-17A,Panel：,10 color full panel example,第四步：查找&订购商业的荧光素抗体,公司网站搜索：BioLegend：北京达科为生物技术有限公司：,多色Panel抗体查找网络工具：,网络工具：http:/,非特异荧光信号的排除,去除死细胞的干扰,死细胞因细胞膜已失去完整性，所以很容易与抗体结合，造成非常强的非特异性染色。一般来说，当细胞标本中的死细胞数目超过5%时，需重新采集标本，或使用“死细胞排除试剂盒”来排除死细胞的干扰。,TruStai
17、n FcX(anti-mouse CD16/32),#101319human TruStain FcX,#422301,去除非特异荧光信号 FcR 封闭,如：单核细胞，B细胞，DC细胞，NK，巨噬细胞，粒细胞，肿瘤细胞等高表达 FcR，在检测这些细胞时，会出现假阳性或假阴性的结果：,样本管加入正常抗体,同型对照加入同型抗体,阴性对照加PBS,抗体FC段非特异性结合位点（普遍存在）,检测抗原位点,荧光组成1、细胞自发荧光2、非特异性标记荧光3、特异性标记荧光,荧光组成1、细胞自发荧光2、非特异性标记荧光,荧光组成1、细胞自发荧光,对照的设置,同型对照,为什么要设同型对照?用于消除由于抗体非特异性
18、结合 到细胞表面的Fc受体及静电结 合而产生的背景染色.如何选择同型对照?与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型 与染色的单克隆抗体 相同种属来源 相同免疫球蛋白及亚型 相同荧光素标记 相同剂量和浓度例如:标记FITC的单克隆抗体为小鼠IgG1亚类抗体，标记PE的单克隆抗体为小鼠IgG2a亚类抗体，同型对照应选用相同浓度和剂量的未免疫小鼠血清的纯化IgG1-FITC和IgG2a-PE.,FMO对照及门的设置,FMO 荧光扣除对照（Fluorescence Minus One）,荧光补偿调节,荧光溢出,CD44 PE-Cy5 补偿微球,CD44 PE-Cy5 单荧光对照,?,补偿对照:
19、细胞 vs.补偿微球,荧光补偿调节,足够大的电压，才能将阴性阳性区分开如果电压过高，不但不能得到更好的结果，反而会加大背景噪音补偿是受电压影响的，电压不同，补偿会不同,PMT 电压,荧光补偿调节,例如：FITC 与 PE 荧光补偿的调节,从PE通道中去除FITC的荧光信号：1.检测两管样品：空白管;FITC 单标管 2.调节补偿（PE-%FITC),使得两群 细胞 FL2的Mean值相同,相同的Mean值,荧光补偿调节,例如：FITC 与 PE 荧光补偿的调节,从FITC通道中去除PE 的荧光信号：1.检测两管样品：空白管;PE 单标管 2.调节补偿（FITC-%PE),使得两群 细胞 FL1的Mean值相同,相同的Mean值,补偿不足及过补偿,谢谢!,Email:,
