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1、药品中杂质研究和分析方法开发,杂质的定义,定义：任何影响药物纯度的物质,前言,按属性无机杂质挥发性杂质有机杂质异构体（手性异构、几何异构）非药用晶型（晶型药物）,杂质分类,按质量标准异构体检查有关物质残留溶剂氯化物硫酸盐钯,按来源工艺杂质降解杂质,杂质来源,杂质可以分为工艺杂质（包括合成中未反应完全的反应物及试剂、中间体、副产物等）、降解产物、从反应物及试剂中混入的杂质等。按照其毒性分类，杂质又可分为毒性杂质和普通杂质等。杂质还可按其化学结构分类，如其它甾体、其它生物碱、几何异构体、光学异构体和聚合物等。,前言,杂质谱分析,6,前言,0.15%,对映异构体杂质属于杂质范畴，有关此类杂质的研究将
2、在手性化合物研究指导原则中另行规定。,前言,杂质检测的手段,杂质研究的特点及研究思路,在杂质研究时，应根据具体的生产工艺，对原料药制备过程中涉及到的无机物进行检测，根据整个研发过程中的实验室规模、中试规模样品的实测情况，对催化剂、重金属等无机杂质带入成品中的可能性进行评估，就质量标准中是否收载这些无机杂质检测项目进行必要的讨论说明。,杂质研究的相关指导原则,ICH Q3A 新原料药中的杂质ICH Q3B 新药制剂中的杂质ICH Q3C 残留溶剂化学药物杂质研究的技术指导原则化学药物残留溶剂研究技术指导原则手性药物质量控制研究技术指导原则已有国家标准化学药品研究技术指导原则,挥发性杂质,指在原料
3、药或辅料的生产过程中，以及在制剂制备过程中使用或产生的，但在工艺过程中未能完全去除的有机溶剂特指有机挥发性化合物在药品生产过程中使用过或产生在药品生产过程中应当去除而未除尽其研究可参考有机溶剂残留量研究的技术指导原则。,挥发性杂质举例,原料药反应溶剂合成原料（无法用有关物质项下控制）吗替麦考酚酯合成中吗啉乙醇反应副产物由合成原料或反应溶剂引入甲苯（苯）、石油醚（正己烷）、正己烷（苯）制剂制备工艺引入（缓、控释微丸包衣工艺；透皮制剂制备工艺；脂质体制备工艺；难溶性药物固体分散）。他克莫司溶于无水乙醇和二氯甲烷中分散 原料药带入（一般不要求）辅料带入（一般不要求）,种类相对固定，ICH规定了69种
4、,ICH有机溶剂分类,挥发性杂质,研究基本内容确定被测残留溶剂确定残留溶剂类别限度确立确定测定方法选择色谱柱和检测器制备供试品和对照品溶液测定条件的优化方法学验证质量标准建立,挥发性杂质,确定被测残留溶剂一般原则(1)工艺中使用二类以上和重结晶用溶剂，及根据工艺特点要求其它溶剂进行残留量研究。(2)建议对合成最后三步使用的三类溶剂也进行研究。建议原则仔细分析，别落下(1)申报资料合成工艺中用到所有有机溶剂(2)液态催化剂等(3)趋势:胺类和羧酸类,挥发性杂质,确定残留溶剂类别残留溶剂分类风险分类（ICH有机溶剂分类）订标准分析角度沸点 高沸点：DMF、DMAC、DMSO、乙二醇、丙二醇、丙三醇
5、、甲酰胺、2甲氧基乙醇、2乙氧基乙醇、（吡啶）管能团酸的、碱的、卤代的，含氮碱性化合物溶解性特殊品种：N-甲基吡咯烷酮、四氯化碳工艺角度：第几步，是否精制溶剂,挥发性杂质,当合成路线涉及此类溶剂时,合成化学发展水平,充分实践,判断使用是否合理,合理,不合理,严格控制残留量,替代研究,临床研究前,临床研究期间,产品上市后,确定残留溶剂类别1类溶剂：应该避免使用,不可避免使用，无论任何步骤使用，均需进行残留量测定,挥发性杂质,确定残留溶剂类别,2类溶剂 建议限制使用27种溶剂，浓度限度范围从50ppm（甲基丁基酮）到3880ppm（环己烷）应对合成过程中所使用的全部第二类溶剂进行残留量研究，为最终
6、制定合理可行的质量标准提供数据支持,挥发性杂质,确定残留溶剂类别,3类溶剂GMP或其他质量要求限制使用应该控制其量，使结果需符合药典相关规定，尤其对在终产品精制过程中使用的第3类溶剂必须进行残留量研究4类溶剂(尚无足够毒性资料的溶剂),挥发性杂质,确定残留溶剂类别,盐酸克林霉素棕榈酸酯举例使用溶剂(种):乙醇、丙酮(精制)、二氯甲烷、三氯甲烷、吡啶与DMF。分类:测定方法确认：考虑DMF沸点较高，吡啶顶空条件下检测灵敏度较低，故上述两种溶剂采用直接进测定，其余溶剂采用顶空进样测定。标准制定：按照ICH规定将二类有机溶剂二氯甲烷、三氯甲烷、吡啶与DMF订入质量标准中，限度参照ICH规定。同时将精
7、制溶剂丙酮列入质量标准中，限度为不得过0.1%,挥发性杂质,有机溶剂残留量表示方法允许日接触量（PDE,mg/天）指某一有机溶剂被允许摄入而不产生毒性的日平均最大剂量。浓度限度：在PDE基础上为便于计算，引入了浓度限度()表示方法。浓度限度()PDE(mg/天)/(1000剂量(g/天)药典附录限度中将剂量初步定为10g/天,限度确立,挥发性杂质,两种表示方法在有机溶剂残留研究中均可行，以PDE值来计算是更精确；而对于某一具体品种来说，以浓度限度来计算更为简便日使用总量不超过10g，就无需进一步计算；如日使用量往往超过10g，则应对限度进行折算无限度规定的有机溶剂（现一般参照3类）二甲苯:0.
8、217%(60%间二甲苯,14%对二甲苯,9%邻二甲苯,17%乙苯),限度确立,挥发性杂质,多种有机溶剂综合影响基本是控制每种溶剂的残留量不超过各自规定的浓度限度（暂时没有考虑多种有机溶剂的综合影响）USP水平决定选择1：药物组分(药物原料、辅料)满足表2中的浓度限度，每日剂量不超过10g；药品通过但当使用的溶剂很多或残留量较大，或每日摄取量高于10g时，建议关注多种有机溶剂的综合影响 USP水平决定选择2：至少药品的一个浓度组分超过限度值，或每日剂量超过10g，溶剂的每日摄取量(以组分和计算)应低于PDE,限度确立,挥发性杂质,确定测定方法,测定方法干燥失重：专属性差GC法(普通)：首选方法
9、顶空进样法直接进样法HPLC法：测定吡啶离子色谱法：测定N-甲基吡咯烷酮气质联用,挥发性杂质,确定测定方法,选择进样方法 直接进样适用范围：沸点高溶剂或受热不易分解样品优点：简便、无需专用设备，绝对进样量大缺点：污染进样口及柱子，溶剂峰响应大，样品分解产物或溶剂杂质峰可能影响测定，对溶剂的纯度要求高,挥发性杂质,确定测定方法,选择进样方法 顶空进样适用范围：沸点低溶剂或样品本身对测定有影响优点：在较低温度下进行，避免组分分解；减少溶解样品的溶剂量和样品本身对色谱系统的干扰和污染，增加色谱柱的寿命缺点：需要特定的顶空进样装置，成本较高，对沸点较高的溶剂检测灵敏度不够，一般多应用于沸点100以下的
10、溶剂,挥发性杂质,确定测定方法,选择定量方法外标法内标法标准加入法:利用加入该组分前后色谱峰响应信号的变化而计算被测组分含量的方法操作:测定供试品,测定供试品对照品使用:边缘产品以标准加入法结果为准 顶空方式基质效应,挥发性杂质,样品的制备不可研磨样品，必须原态取样不可超声、不能加热溶解样品（直接进样法）样品置顶空瓶中压盖后可以超声、加热测定酯类溶剂时不能采用酸或碱溶液，以免发生水解,挥发性杂质,样品的制备测定含氮的碱性溶剂时，供试品溶液应不呈酸性，以免被测物与酸反应不易汽化测定含羧基的酸性溶剂时，供试品溶液应不呈碱性，以免被测物与碱反应不易汽化 如：测定氟伐他汀钠(pH8.010.0)中乙酸
11、残留量，不出峰，需对其甲酯化后测定,挥发性杂质,制备供试品和对照品溶液,对照品溶液的制备对照品溶液：必须与供试品溶液相同溶剂。苯、甲苯、三氯甲烷等水溶性不好的溶剂，可先用少量DMF等溶解待查溶剂，再用水稀释。2010版新增：采用与制备供试品溶液相同的溶剂制备对照品溶液。如用水作溶剂，应先将待测有机溶剂溶解在50二甲亚砜或N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再用水逐步稀释。,挥发性杂质,制备供试品和对照品溶液,供试品和对照品溶液浓度确定根据残留溶剂的限度规定配制供试品溶液，浓度应能满足系统定量测定的需要一般供试品取样量为0.11g限度试验：对照品溶液的浓度可按残留溶剂规定的限度配置定量测定：按实际残留量
12、配置，浓度相差最好不超过2倍为宜。必要时应重新调整,挥发性杂质,顶空进样基质效应顶空气体中单个组分的含量既与其本身的挥发性有关，又与样品基质有关。特别是那些在样品基质中溶解度大（分配系数大）的组分，基质效应更为明显 标准溶液必须有与原样品相同或相似的基质，否则可能导致定量误差将会很大标准加入法可以有效地排除基质效应的影响；当标准加入法结果与内标法结果系统偏差约10%时，可以认为方法存在明显的基质效应,挥发性杂质,制备供试品和对照品溶液,盐酸克林霉素棕榈酸酯举例直接进样(吡啶与DMF):样品在甲醇和乙醇中溶解性均较好，考虑在极性柱中甲醇出峰较快，干扰较少，故采用甲醇为溶解样品的溶剂顶空进样:样品
13、在水中溶解性较好，故首选。同时考虑三氯甲烷在水中溶解性较差，最后采用5%DMF水溶液作为顶空测定溶解样品溶剂,挥发性杂质,测定条件的优化,顶空条件优化平衡温度：溶剂的沸点，一般应比溶解用溶剂沸点低10以上。在灵敏度能满足的条件下，尽量采用较低的平衡温度水：顶空温度不宜超过85 EP/USP规定为80DMSO/DMF：顶空温度不宜超过115 EP/USP规定为105,挥发性杂质,测定条件的优化,顶空条件优化平衡时间：取决于组分分子从样品基质到气相的扩散速度。扩散速度越快所需时间越短。扩散系数与分子大小、介质黏度及温度有关。温度越高，黏度越低，扩散系数越大。提高温度可以缩短平衡时间顶空时间一般15
14、45min(药典3045min)过长可能引起顶空瓶的气密性变差过短不能保证气-液两相达到平衡,挥发性杂质,测定条件的优化,顶空进样提高灵敏度方法盐析作用(基质效应)在水溶液中 加入无机盐（如无水硫酸钠）来改变挥发性组分的分配系数但当盐浓度小于5%时几乎没有作用，故常用高浓度(甚至饱和)盐析作用对极性组分的影响大于非极性组分的影响在水溶液中加入盐之后，溶液体积会变化，定量线性范围可能变窄,挥发性杂质,测定条件的优化,顶空进样提高灵敏度方法有机溶液中加入水：水要与有机溶剂相溶，减少有机物在有机溶剂中的溶解度，增大其在顶空气体的含量氯仿在DMF顶空法中由于二者结合能力强，致使其检测灵敏度降低，当加入
15、等量的水后，检测灵敏度显著增加。即使加水后样品重新析出，不影响氯仿从样品中转移至溶剂中的转移率（必须经回收考察）,挥发性杂质,测定条件的优化,顶空进样提高灵敏度方法调节溶液的pH：对于碱和酸，通过控制pH可使其解离度改变，或使其待测物的挥发性变的更大，从而有利于分析,挥发性杂质,测定条件的优化,柱温优化提高柱温：各组分的挥发加快，分配系数减少，不利于分离降低柱温：各组分在两相中的传质速度下降，使峰形扩张，甚至引起拖尾，延长分析时间选择原则：在使难分离物质能得到良好的分离、分析时间适宜、峰形不拖尾的前提下，尽量采用低柱温注意：不得超过色谱柱的最高使用温度,挥发性杂质,测定条件的优化,柱温优化对于
16、一个分析样品,各组分都有一个最佳柱温填充柱:约在组分的沸点左右；毛细管柱:约比沸点低50左右当样品组分较少,且极性、沸点差异较小时,一般采用恒温操作当样品组分较多,而且极性、沸点(组分最高、低沸点差大于80100,需程序升温)差异较大时,可选择程序升温法,挥发性杂质,测定条件的优化,进样口温度优化由待测组分挥发性、沸点、稳定性、进样量决定。一般应高于组分沸点保证迅速气化 测定热不稳定的样品时要降低进样口温度以免样品分解对挥发性不好的样品则要增加进样口温度使其完全气化,挥发性杂质,方法学验证,总则：首先明确将其归为定量检查或限度检查验证内容系统适用性专属性准确度（回收率）线性灵敏度（检测限、定量
17、限）耐用性,挥发性杂质,无机杂质,是指在原料药及制剂生产或传递过程中产生的杂质，这些杂质通常是已知的，主要包括：反应试剂、配位体、催化剂、重金属、其它残留的金属、无机盐、助滤剂、活性炭等。包括制备过程所用的金属器皿、工具、管道引入的无机阴离子、金属离子金属杂质等,无机杂质,残留金属 在原辅料合成中可能用到金属催化剂或金属试剂，如铂、钯、锌、铁、铬等，这些金属可能在原料药中残留（可能以最初形式存在，也可能由于后续化学过程以其他形式存在）。原辅料中残留的金属会进一步带入到制剂中。这些残留的金属通常不具有治疗作用，基于安全性和质控的需要进行严格控制,如需对某种（些）特定金属离子或上述方法不能检测到的
18、金属离子作限度要求，可采用专属性较强的原子吸收分光光度法或具有一定专属性的经典比色法（如采用药典已收载的铁盐、铵盐、硒等的检查法检测药品中微量铁盐、铵盐和硒等杂质）。,强化安全性风险较高的辅料品种质量控制 目前部分企业非法使用工业明胶为原料生产药用胶囊的现象时有发生，在胶囊标准中规定铬含量不得过2ppm，采用原子吸收分光光度法测定,无机杂质,金属离子硒毒性杂质，如某些甾体激素类药物，在生产中使用了二氧化硒脱氢，可能引入该杂质砷盐在中国药典二部收载有两种方法：古蔡氏法和Ag-DDT法(二乙基二硫代氨基甲酸银法)。一般可根据需要任意选择，须注意的是各供试品中规定含砷限度不同,采用改变供试品取用量的
19、方法来适应要求,而不采用改变标准砷溶液取用量的办法。因标准砷斑过深或过浅均会影响比色的准确性.，一般取用2ml标准砷溶液进行检测Ag-DDT法原子吸收原子荧光ICP-MS,无机杂质,通常情况下，不挥发性无机杂质采用炽灼残渣和重金属检查法进行检测。重金属 在pH3.5的醋酸盐缓冲液的条件下能与显色剂（硫代乙酰胺试夜）或硫化钠作用的所有金属盐类的总称。包括银、铅、汞、铜、镉、铋、锑、锡、砷、镍、钴、锌盐等，生产中遇铅的机会较多，又易在体内积蓄中毒，因此检查时多以铅为代表限度：口服的原料药控制在20ppm注射用的原料控制在10ppm,无机杂质,炽灼残渣 系指硫酸化灰分，以转化为硫酸盐的重量计算，以考
20、察不挥发各种无机杂质。化合物本身炽灼后应无残留，残留物多为金属的氧化物或硫酸盐，主用于考察阳离子，与阴离子无关含氟或碱金属的药物采用铂金坩埚检测以避免腐蚀,重金属的分类,按风险级别分类管理第1类金属:具有显著安全性担忧，已知或怀疑的致癌性 其他显著毒性1A亚组：Pt(铂)、Pd(钯)1B亚组：Ir（铱）、Rh（铑）、Ru(钌)、Os(锇)1C亚组：Mo(钼)、Ni(镍）、Cr、V(钒)第2类金属:具有低的安全性担忧，潜在的较低毒性，如Cu、Mn等 第3类金属:安全性担忧最小，无明显毒性，如Fe、Zn等,EMA金属催化剂或金属试剂残留量限度规定指导原则*Pt以六氯铂酸形式*所列金属残留总和不得超
21、过指定的限度,允许日接触量（permitted daily exposure,PDE）浓度限度（ppm）PDE（g/天）/每日给药量（g/天),残留金属检测方法 合适的、经验证的、专属性的方法金属残留的形式可能不同于催化剂和试剂的初始形式公认的药典方法或其他适宜的方法 仅有第2类或第3类金属，可采用非专属性的方法 对于1B亚组金属，可以接受0.5ppm的检测限ChP重金属检查法半定量测定方法，通常不适用于金属的定量测定如：某注射剂原料药制备工艺用到无水钯碳催化剂，钯的PDE 10g或浓度限度1ppm，本品采用ChP重金属检查法，限度10ppm，且专属性差，难以有效控制钯残留量,金属试剂残留量控
22、制,ChP重金属检查法 远远不够的措施 某注射剂原料药制备工艺用到无水钯/碳催化剂，钯的PDE 10g或浓度限度1ppm，本品采用ChP重金属检查法，限度10ppm，且专属性差，难以有效控制钯残留量。,无机杂质的分析方法,对于采用新生产工艺生产的新药，鼓励采用离子色谱法及电感耦合等离子发射光谱质谱（ICP-MS）等分析技术，对产品中可能存在的各类无机杂质进行定性、定量分析，以便对其生产工艺进行合理评价，并为制定合理的质量标准提供依据。,无机杂质,无机阴离子硫酸盐、氯化物信号杂质，不作为质量标准的普遍要求。硫化物有毒杂质，应注意药典附录硫化物检查法中标准硫斑固定为5g的硫(s)，供试品的量应与之
23、匹配氰化物有毒杂质，药典收载中纳入两种方法，可以检出达到痕量级。,由于硫酸根离子、氯离子、硫离子等多来源于生产中所用的干燥剂、催化剂或pH调节剂等，考察其在产品中的残留量，可反映产品纯度，故应采用药典中的经典方法进行检测。如生产中用到剧毒物（如氰化物等），须采用药典方法检测可能引入产品中的痕量残留物。厄贝沙坦中的叠氮化钠USP已经收载,通则,规定药物中元素杂质含量的限度,3.4.1 美国药典对限量元素的控制检测方案：USP已经制订对药品重金属或限量元素总体控制解决方案，增加三个新的通则：元素杂质-限度、元素杂质-测定法、膳食补充剂中的元素杂质。,通则,通则,规定膳食补充剂以及它们的成分,描述测
24、定元素杂质的两种常用方法：ICP-AES(方法1)和ICP-MS(方法2)，并提出选择方法的原则。,3.4 如何建立限量元素（重金属）检测体系,Step 1,Step 2,Step 3,合理设定目标检测元素和限量,分析研究元素形态和价态，科学评价限量元素安全性,发挥各种方法的互补性，不断完善检测体系,3.4 如何建立限量元素（重金属）检测体系,3.4.2 中国药典应采取的对策：中国药典(2010年版)新增电感耦合等离子体原子发射光谱法、离子色谱法，修订原子吸收光谱法、重金属检查法等，组成了较完整的检测方法体系，使检测方法基本达到了国际先进水平，在灵敏度、专属性、准确性等方面均能满足各种重金属（
25、无机物）检测需求。,表3 各种元素分析方法的适用性,3.4 如何建立限量元素（重金属）检测体系,3.5 原子吸收测定注意事项,、石墨炉原子不能同时测定浓度范围很宽的样品。对于高浓度的溶液，必须稀释到适当的浓度范围，或选用高精度的测定方法，如分光光度法或发射光谱法。、由于原子吸收法的线性范围窄，绘制正确的工作曲线显得尤为重要，且要注意以下几点：绘制工作曲线要取5（5-7）个点以上，每一个点要重复测定两次或多次，直到平行样的测定值满足要求后，再进行下一个点的测定。标准曲线和待测样品必须使用相同的溶剂系统。样品浓度应工作曲线浓度范围内。较理想的线性范围吸光度在0.10.5之内，如浓度再高，标准曲线就
26、会显著地弯曲,3.5 原子吸收测定注意事项,、样品稀释对分析结果的影响：样品的浓度范围不在仪器工作范围之内，就要稀释样品。值得注意的是稀释的倍数不宜过大，用石墨炉原子吸收进行检测时这一点尤为重要。、溶剂对测定的影响：对空白值的影响：升高 对灵敏度的影响：降低由于不同来源的酸，杂质含量不同，因此，在用石墨炉分析时，一定要注意：标准曲线与样品使用的酸应为同一批号（同一瓶），在石墨炉原子吸收分析中尤为重要。,3.5 原子吸收测定注意事项,、样品稀释对分析结果的影响：样品的浓度范围不在仪器工作范围之内，就要稀释样品。值得注意的是稀释的倍数不宜过大，用石墨炉原子吸收进行检测时这一点尤为重要。、溶剂对测定
27、的影响：对空白值的影响：升高 对灵敏度的影响：降低由于不同来源的酸，杂质含量不同，因此，在用石墨炉分析时，一定要注意：标准曲线与样品使用的酸应为同一批号（同一瓶），在石墨炉原子吸收分析中尤为重要。,3.5 原子吸收测定注意事项,最为常用的是火焰原子化器、石墨炉原子化器 氢化物原子化器由适用于碲、锡、硒、锑、铅、锗、铋、砷等元素测定。冷蒸气发生原子化器专门用于汞的测定。,有机杂质,包括工艺中引入的杂质和降解产物等，可能是已知的或未知的、挥发性的或不挥发性的。由于这类杂质的化学结构一般与活性成分类似或具渊源关系，故通常又可称之为有关物质。,与无机杂质及残留溶剂比较，有机杂质(即有关物质)的研究与控
28、制要复杂得多，在杂质的分离鉴定、杂质来源分析、杂质安全性研究、杂质限度确定等方面，都需要结合药物的结构特点、制备工艺、贮藏稳定性、临床应用特点等进行大量的深入细致的研究工作。,在药品质量研究方面，国内的研究水平与欧美等发达国家的原研药尚存在一定差距。这种差距，在原料药方面主要表现为有关物质的研究与控制水平；在制剂方面，除杂质的研究与控制外，差距还包括溶出度研究水平。,有机杂质的分析方法,有机杂质的检测方法包括化学法、光谱法、色谱法等，因药物结构及降解产物的不同采用不同的检测方法。通过合适的分析技术将不同结构的杂质进行分离、检测，从而达到对杂质的有效控制。随着分离、检测技术的发展与更新，高效、快
29、速的分离技术与灵敏、稳定、准确、适用的检测手段相结合，几乎所有的有机杂质均能在合适的条件下得到很好的分离与检测。,有机杂质的分析方法,由于各种分析方法均具有一定的局限性，因此在进行杂质分析时，应注意不同原理的分析方法间的相互补充与验证，如HPLC与TLC及HPLC与CE的互相补充，反相HPLC系统与正相HPLC系统的相互补充，HPLC不同检测器检测结果的相互补充等。,杂质谱的比较多种互补,不同色谱系统（流动相、色谱柱、波长）不同检测器（uv、DAD）不同原理的方法-分离或检测,药物颜色有关物质控制的方法之一,药物本身的化学结构。有颜色药物的分子结构中一般具有不饱和碳链和不饱和碳环的共轭体系，颜
30、色的深浅又与N、S、O 等杂原子在这些共轭体系中的原子种类和数目有关。制备工艺中的杂质也是药物颜色的重要引入因素。另外部分药物在放置过程中，由于氧化、水解，络合、聚合等原因使药物的颜色逐渐加深，如见光易变色的药物维生素C、磺胺嘧啶、硫酸链霉素、葡萄糖、喹诺酮类药物等。,药物颜色检查的意义,颜色（溶液的颜色）检查是药物纯度检查的重要指标。控制生产过程中可能引入的微量有色杂质；控制在贮藏过程中产生的有色杂质。目前多国药典如中国药典（CP）、美国药典（USP）、英国药典（BP）和日本药典（JP）等都收载药物颜色或溶液颜色检查项目。,药物颜色研究的一般原则,一般来说，对于注射用原料药、易变色的非注射用
31、途原料药，以及溶液剂和注射剂，均应进行颜色或溶液颜色检查。溶剂尽量选择水，辅助以酸、碱或有机溶剂。一般易溶于水的药物，供试液浓度应尽量选择在之间。,溶液颜色检查的目的,溶液颜色,自身性质,纯度,杂质含量,-简易、直观、快速、综合的对有色杂质进行检查,药品溶液的颜色与药品本身的性质、纯度、杂质的含量有着密切的关系，药品颜色的变化是药品内在质量改变最直观的表现，往往意味着降解物的产生、增加，纯度或主成分含量的降低，药品在变质、失效。因此，各国药典附录均有药品溶液颜色检查法的规定，从而可以对药品质量进行简易、直观、快速和切实有效的监测。特别是一些组成复杂，甚至连组成尚不明确的中药、抗生素生化类提取、
32、发酵工艺生产的药品，无法对杂质进行定量检测，而该药品的稳定性又与其颜色联系密切者，适宜设立颜色检查项。,稳定性差,质量与颜色联系紧密的,安全性要求高,用仪器定量测杂质困难,注射剂用原料,仅在紫外区查杂质,成分复杂,变质就变色,检查颜色的品种,适宜进行溶液的颜色检查的原料,建立方法时要考虑的问题,溶剂,浓度,稳定性,临床安全性需要工艺生产能力同类产品水平,溶液的颜色,制订限度时要考虑的问题,主成分纯度,杂质的含量,稳定性数据,临床安全性需要工艺生产能力同类产品水平,颜色的限度,应用色差计转换进口药注册标准-举例,溶液的颜色 取本品0.5g，加水10ml溶解后，溶液应无色；如显色，与同体积的比色液
33、（取棕红色贮备液1.8ml加8.2ml水，混匀）比较（中国药典2010年版二部附录 A第一法），不得更深。,色差计法应用举例,说明：企业标准按EP检查，规定“与B5号标准比色液（EP第5版溶液的颜色）比较不得更深”。因EP标准比色液从三原色开始就与中国药典不同，如按此检查会有困难，故采用色差计进行了对比测定，结果EP的B5号标准比色液的色差值（E*=3.58）与中国药典BR3号（E*=3.19）和BR4号（E*=4.46）的中值（3.82）较为接近，约相当于BR3.5号。因BR3号是取棕红色贮备液1.5ml加8.5ml水，BR4号是取棕红色贮备液2.0ml加8.0ml水配制而成，所以本次复核将
34、棕红色贮备液1.8ml加8.2ml水配制了专用比色液，该比色液的E*为3.64，与EP B5号标准比色液的色差值几乎一致，按此转换限度既不改变质控原有水平，又方便在国内检验。,应用色差计转换进口药注册标准-举例,79,杂质控制理念的变迁,纯度控制,限度控制,杂质谱控制,药品中的诸杂质的种类、含量,关注单杂、总杂的控制,关注主成分的含量,依据制备工艺，分析潜在的工艺杂质基于结构特征，分析可能的降解产物 通过强制降解试验，验证降解产物的存在与检出与原研市售品的杂质情况对比研究，明确杂质异同,杂质谱分析的切入点,1、杂质谱分析 甄别需重点控制的遗传毒性杂质某原料药，为绕开专利，调整了工艺路线，杂质谱
35、分析可能会产生具有遗传毒性警惕结构单元的副产物。,副产物,毒物数据库中警惕结构,主成份,2、杂质谱分析 建立针对性控制特定杂质的 分析方法,某药物，基于工艺的杂质谱分析可能产生双叠氮杂质B，但起初建立的分析方法未检测到，鉴于其遗传毒性，重新建立针对性方法检出，尽管含量低，仍予以严格控制（杂质对照品法，ppm水平）。,从杂质谱分析入手，建立针对性分析方法-杂质研究中科学的思维模式,83,在以DNA反应物质为主要研究对象的体内/体外试验中，如果发现它们对DNA有潜在的破坏性，那可称之为基因毒性对没有进行体内实验的情况下，也可以根据关联系做一些相关的体外实验去评估该物质在体内的毒性如果没有关联评估的
36、，体外基因毒性物质经常被考虑为假定的体内诱变剂和致癌剂按照目前的法规来说，（体内）基因毒性物质在任何摄入量水平上对DNA都有潜在的破坏性，这种破坏可能导致肿瘤的产生。因此，对于基因毒性致癌物，不能说“不存在明显的阀值，或是任何的摄入水平都具有致癌的风险,有机杂质基因毒性杂质,84,可接受风险的摄入量,对于那些可以与DNA进行反应的化合物，由于在较低的剂量时机体保护机制可以有效的运行，按照摄入量由高到低所造成的影响进行线性推断是很困难的。目前，对于一个给定诱变剂，我们很难从实验方面证明它的基因毒性存在一个阀值。特别是对某些化合物，它们可以与非DNA靶点进行反应，或一些潜在的突变剂，在与关键靶位结
37、合之前就迅速失去了毒性。由于缺乏支持基因毒性阀值存在的有力证据，而使得我们很难界定一个安全的服用量所以有必要采取一个新观点：确定一个可接受其风险的摄入量,有机杂质基因毒性杂质,85,可接受风险的摄入量,可接受其风险的摄入量一般通用的被定义为 Threshold of Toxicological Concern(TTC)。具体含义为：一个“1.5ug/day”的TTC值，即相当于每天摄入1.5ug的基因毒性杂质，被认为对于大多数药品来说是可以接受的风险（一生中致癌的风险小于100000分之1）。按照这个阀值，可以根据预期的每日摄入量计算出活性药物中可接受的杂质水平在特定的条件下一些基因毒性杂质也
38、可以有较高的阈值。如接触时间比较短等，这个需要根据实际情况再进行推算,有机杂质基因毒性杂质,必须要强调的是TTC是一个风险管理工具，它使用的是概率方法，意思为：假如有一个基因毒性杂质，并且我们对它的毒性大小不太了解，如果它的每日摄入量低于TTC值，那么它的致癌的风险将不会高于110-5的概率所以TTC不能被理解为绝对无风险的保障,87,有实验依据的TTC值的确认,有足够的（实验性的）证据来支持阀值界定的基因毒性杂质对于这类有足够的证据来表明其基因毒性阀值的化合物，可以参考“Q3C Note for Guidance on Impurities:Residual Solvents.”中2级溶剂的
39、规定，计算出了一个“允许的日摄入量”（PDE）,有机杂质基因毒性杂质,88,无实验依据的TTC值的确认,没有足够的（试验性的）证据来支持阀值界定的基因毒性杂质不能进行阀值鉴定的基因毒性杂质的可接受剂量评价应该包括药学的和毒理学的评价。一般来说，如果避免毒性是不可能的，那么药学的评价措施应该以ALARP的（as low as reasonably practicable）控制水平为指导原则,有机杂质基因毒性杂质,89,含有多个基因毒性杂质的评估,EMEA CHMP结构不同的单个杂质的限度应该小于1.5ug/day结构相似的杂质总和的限度应该小于1.5ug/dayFDA（和EMEA类似）单个杂质造
40、成的癌症风险机率应该小于10-5有相同作用机制的结构相似的杂质，其含量总和应该参考1.5ug/day的限量进行评估,有机杂质基因毒性杂质,90,含有多个基因毒性杂质的评估,单个基因毒性杂质可以参考文献来确定多个基因毒性杂质（3个以下）积累的风险相对于单个杂质的风险上升不大，可以忽略药物中含有3个基因毒性杂质，不管结构是否相似，在法规中是允许的（只要有充分的数据）存在四个以及以上的基因毒性杂质的时候，需要根据实际情况考虑,有机杂质基因毒性杂质,91,药学评价,实际生产中尽量避免使用该类物质如果在合成路线、起始物料方面没有更好选择，则需要提供一个正当的理由。就是物质中能引起基因毒性和致癌性的结构部
41、分在化学合成是不可避免的假如基因毒性杂质被认为是不可避免的，那么应该采取技术手段尽可能的减少基因毒性杂质在产品中的含量，使其符合安全的需要或使其降低到一个合理的水平。对于活性中间体、反应物、以及其它化合物的化学稳定性都应该进行评估,有机杂质基因毒性杂质,应该指明涉及到的所有具有基因毒性或有致癌性的化学物质，如所用试剂、中间体、副产品等。更进一步，在药物活性物质中没有出现的基因毒性反应物和有基因毒性结构（alerting structure）的物质，都应该被考虑，应该有合理的分析方法去检测和量化这些杂质的残留量,93,基因毒性杂质磺酸盐的风险评估,临床研究发现甲磺酸酯的DNA 烷基化作用会导致诱
42、变效应，其中甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯已有这方面报导，因此有理由怀疑其它低分子量磺酸（如对甲苯磺酸）的烷基酯可能也存在着类似的毒性影响。尽管无数据表明这些酯对人的毒性影响，然后依然有上述基因毒性物质以杂质的形式存在于含磺酸酯类药物活性成分的药品中的潜在风险,有机杂质基因毒性杂质,94,药物活性成分的生产是否涉及到在甲磺酸（或羟乙基磺酸，苯磺酸，对甲苯磺酸）或相应的酰氯存在的情况下，使用了低级脂肪酯，如甲醇，乙醇，正丙醇或异丙醇的情况？如果是这种情况的话，甲磺酸烷基酯或类似苯磺酯烷基酯和对甲苯磺酸烷基酯的形成可能性是否已被降至最低？是否存在有效的精制步骤？设备（特别是接触到磺酸试剂的设备）的清洗程序
43、是否涉及到低级脂肪醇的使用？是否有适宜的质量标准和已验证的分析方法可以证实药物活性成分中的磺酸烷酯或磺酸芳基酯杂质处于TTC以下？,有机杂质基因毒性杂质,基因毒性杂质磺酸盐的风险评估,95,是否检查了起始物料，如甲磺酸盐（苯磺酸盐，对甲苯磺酸盐，羟乙基磺酸）中的烷基磺酸酯或芳基磺酸酯杂质（如甲磺酸中的EMS 和MMS）及相应的酰氯？是否有这些杂质的适宜标准和验证过的方法？当被磺酸酯或相关物质所污染了的磺酸作为起始物料用于药物活性成分时，是否能保证药物活性成分中潜在基因毒性杂质不超过其TTC值？应当要考虑各种烷基或芳基取代磺酸酯杂质的累加风险,有机杂质基因毒性杂质,基因毒性杂质磺酸盐的风险评估,
44、甲磺酸烷基酯，如甲磺酸甲酯（MMS）和甲磺酸乙酯（EMS），是甲磺酸与甲醇，乙醇，或其它低级醇形成的酯。特别是在以甲磺酸盐或甲磺酸酯形式存在的药物活性成分中或其合成过程中用到了甲磺酸的药物活性成分中，甲磺酸烷基酯会被视为潜在杂质 在以羟乙基磺酸盐，苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐形式存在的药物活性成分中也会发现类似的磺酸烷基酯或芳基酯污染。需说明出现这些污染的风险,97,如在药物活性成分生产的最后一步合成步骤用到了磺酸衍生物，应将其纳入风险分析是否对回收溶剂中磺酸酯类杂质（如，乙醇中的EMS，甲醇中的MMS，异丙醇中的IMS）的富集和残留进行了控制？是否能排除以甲磺酸盐，羟乙基磺酸盐，对甲苯磺酸盐或苯磺
45、酸盐形式存在的药物的活性成分，或其相关制剂，在储存过程中形成烷基或芳基磺酸酯？,有机杂质基因毒性杂质,基因毒性杂质磺酸盐的风险评估,是否能排除以甲磺酸盐，羟乙基磺酸盐，对甲苯磺酸盐或苯磺酸盐形式存在的药物活性成分在制成最终制剂的过程中形成烷基或芳基磺酸酯，如在制粒过程中使用了醇？是否有足够灵敏的的方法可以检测到制剂中的（处于TTC水平的）这些杂质？,99,基因毒性杂质卤代烃的风险评估,有数据表明氯乙烷、氯甲烷为基因毒性杂质，因此有理由怀疑其他低分子卤代烃类也有类似的作用。在生产中应该对其进行相应的控制,有机杂质基因毒性杂质,100,在氨基物盐酸盐使用醇类溶剂精制的时候，基本都会产生卤代烃产生的
46、条件和温度、水分、浓度、时间等有关系对于控制低级卤代烃的方法可以参考控制甲磺酸酯的相关建议,基因毒性杂质卤代烃的风险评估,有机杂质基因毒性杂质,101,有充分阈值相关机理证据（实验）的遗传毒性化合物参照Q3C“杂质指导原则”中二类溶剂的限度确定方法计算 无充分阈值相关机理证据（实验）的遗传毒性化合物替代研究，消除杂质 如无法避免，控制在“合理可行的最低限量”,小结,1.5g/日 或 1ppm,如某药的最大日剂量为300 mg/日，含某一杂质为无充分阈值遗传毒性物质，故毒性关注阈值（TTC）为 1.5 g/日，其限度为5 ppm或5 g/g,有机杂质基因毒性杂质,102,小结,有机杂质基因毒性杂
47、质,103,原料药起始原料中间体副产物副产物的副产物制剂降解杂质辅料的杂质原料药的工艺杂质,有机杂质有关物质,原料药和制剂有关物质方法的侧重面,Company Logo,名词解释,已鉴定杂质Identified Impurity,特定杂质Specified Impurity,潜在杂质PotentialImpurity,杂质谱Impurity Profile,已确证了结构特征的杂质,在质量标准中规定检查并有自己限度标准的杂质。已鉴定或未鉴定,按照理论推测在生产或贮藏过程中可能产生的杂质，实际产品中不一定存在,存在于药品中的杂质组成或模式,105,已知杂质未知杂质特定杂质非特定杂质例：杂质 RRT
48、0.7 任意单个杂质 总杂质杂质“一致性”评价的原则大于鉴定限的特定杂质应结构一致，含量相当非特定杂质不得大于鉴定限总杂质的量也应基本一致,有机杂质有关物质,106,检测方法选择HPLC是分析有机药物杂质的常用的有效方法HPCE是分析水溶性药物杂质的有效方法HPTLC是HPLC的有效互补方法不同类型的检测器的互补作用,有机杂质有关物质,107,注意不同品牌柱子在耐用性方面的研究：特别当杂质峰与主峰的分离情况不十分完美时，应用不同品牌的柱子进行比较如果柱子耐用性差的情况时应考虑：建立有难分离物与主成分分离度要求的系统适应性试验体系在标准中指定柱子的型号与规格在确定特定杂质的相对保留时间时（自身对
49、照法，以相对保留时间定位特定杂质，或将定位的杂质进行校正因子校正后，并对该杂质有特定的限度要求），应进行不同品牌的比较,有机杂质有关物质,108,确定有关物质出峰完毕的保留时间时，应进行不同品牌的柱子，对各杂质出峰时间的比较，以防制定色谱记录时间不妥，漏检杂质当不同品牌而引起以上各因素不固定时，应在标准中注明品牌,有机杂质有关物质,109,HPLC流动相的选择与优化,对流动相的选择同样以出峰时间、分离情况、柱效为主要依据，但也应进行耐用性方面的考查pH在标准值略微变化时对上述3个因素的影响是否明显，如明显应选择最佳pH值，并在标准中注明。流动相比例变化的影响。流速变化的影响温度变化的影响,有机
50、杂质有关物质,110,HPLC供试品溶液浓度的选择,较高浓度的样品液一般利于杂质检出，但要注意样品量超载情况，要选择一个即有一定的浓度确保检出灵敏性，又要防止超载、影响分离和柱效。标准方法中应制定出合理的仪器检测灵敏度。一般在灵敏度规定的标尺下，应能定量检出0.1%的杂质，既0.1%的杂质峰的信噪比10,有机杂质有关物质,111,波长的选择,选择的原则如果是外标法，则应在该杂质的最大吸收波长处如果是自身对照法则应是大部分主要杂质与主成分均在此波长下有吸收，并结合两者的吸收情况综合考虑选择合适的波长原料药的主要杂质是后几步的中间体、副产物以及易降解物,有机杂质有关物质,112,采用自身对照法还应
