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1、药物分析,主讲:秦大伟,第五章 体内药物分析,Company Logo,第五章 体内药物分析,体内药物分析定义,体内药物分析是指体内样品（生物体液、器官或组织）中药物及其代谢或内源性生物活性物质的定量分析。,Company Logo,第五章 体内药物分析,分析意义,与体内药代动力学研究和临床治疗药物监测密切相关，直接关系到药物的体内作用机制探讨与质量评价和药物临床使用的安全、有效与合理。,Company Logo,第五章 体内药物分析,分析样品种类,血液,尿液,唾液,头发,脏器组织,其它特殊样品?,Company Logo,第五章 体内药物分析,分析目标,药物在体内的某些代谢产物常具有一定的生
2、理活性,它们在体内的变化规律对母体药物的药理学与毒理学评价特别重要.,机体内源性生物活性物质往往参与机体重要的生理过程,其变化规律的异常改变也与某些疾病的发病机制密切相关,母药,药物特有代谢产物,体内内源性生物活性物质,Company Logo,第五章 体内药物分析,分析对象,人,动物,鼠,兔,犬,大鼠,小鼠,雄,雌,Just a joke,等等,猴,猩猩,都是一些志愿者,也有一些不知情的人,须动物管理与使用委员会同意,Company Logo,分析对象,Company Logo,第五章 体内药物分析,药物在体内的形态,游离型代谢产物,游离型原药,结合型原药,结合型代谢产物,情形极为复杂,缀合
3、物,分子间力结合,化学共价结合,称为,两类,Company Logo,四、体内药物分析的特点,体内样品性质及分析特点,采样量少,药物浓度低,干扰物质多,数毫升,至数十微升,一般在特定条件下采集,且不易重新获取,生物活性物质的浓度在纳克级到微克级水平,甚至皮克级水平,蛋白质,脂肪,尿素,钾,钠,代谢产物,内源性物质.,样品需要分离富集,或者衍生化处理才能分析,样品分析方法需要高灵敏度与专属性,分析工作量,数据处理和结果阐明较为复杂,Company Logo,五、体内药物分析方法,体内样品分析方法,色谱及其联用方法,免疫学方法,生物学微生物学方法,HPLC,GC,HPLC-MS,HPLC-MS/M
4、S,GC-MS,GC-MS/MS,放射（RIA）荧光（FIA）酶（EIA）,适合小分子及代谢物，蛋白质大分子药物等,生物大分子药物分析,抗生素分析,Company Logo,第一节 常用体内样品的制备与贮藏,常用样品的种类,(一)血样:药物在体内主要依靠血液运输,血药浓度可作为药物在作用部位浓度的指标.血浆(plasma)血清(serum)全血(二)唾液:很少采用(三)尿液:用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度，药物代谢物及其代谢途径、类型、速率等的研究；临床上用于判断患者是否违反医嘱用药。,Company Logo,其它：头发、肝器组织、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、
5、粪便。,常用样品的种类,Company Logo,采集和制备,1、血样：一般从肘静脉采血，也可从毛细管采血。每次采血1-5ml，动物采血时一般不超过动物总血量的十分之一。2、血浆：静脉离心5-10分钟，使与血细胞分离；3、血清：静脉血放置30-60分钟。1000g离心5-10分钟。4、全血：加抗凝剂，不离心，血浆和血细胞分布均匀。,采集方法,Company Logo,2尿样 目的：药物剂量回收，药物清除，药物代谢和生物利用度 特点：浓度高，易于收集，体内代谢研究，应水解分 离 采集方法：随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿等，定时采集。贮藏:健康人排出的尿液颜色淡黄至黄褐色,pH在4.88.0之间。3
6、唾液 唾液中药浓与血浓相关性密切 收集方法 濑口15min钟后采集，离心 收集,采集方法,Company Logo,组织采集：先取各种组织，应用匀浆器均匀化制成水性基质匀浆液，再以适当方法萃取。组织样品要经过蛋白沉淀：甲醇、乙腈、高氯酸、三氯乙酸沉淀。酸、碱水解：将组织水解掉酶水解：应用酶将组织水解掉其它：头发等,组织样品,药物在组织中的分布提供重要的体内动力学过程,Company Logo,体内样品贮存与处理,冷藏与冷冻,去活性,-20到-80,低温终止酶的活性,其它方式去除酶的活性，防止样品进一步代谢分解,样本量大，分析时间长，要保证药物不变质，须贮存与处理,Company Logo,1血
7、样（血浆、血清）及时分离冷藏，-70加入稳定 剂NaF,2尿样 尿中水、无机盐、尿素等细菌的生长，4保存 加入防腐剂 a1%甲苯 b饱和氯仿 cpH改变,3唾液：同血样,冷冻与冷藏,Company Logo,去活性,去活性：为防止酶进一步分解体内待测组分，采样后必须终止酶的活性。常用方法有“液氮快速冷冻法、微波照射法、匀浆及溶淀，加酶活性阻断剂、抗氧化剂、样品煮沸等。,Company Logo,第二节、体内样品的前处理,体内样品的前处理是体内药物分析中极为重要的环节,也是分析中最困难、最繁复的工作。,请先看如下处理步骤与方法,Company Logo,第二节 体内样品分析的前处理,处理步骤与方
8、法,Company Logo,预处理的目的,使待测药物游离,满足测定方法要求,改善分析环境,药物进入体内后有多种存在形式，进行预处理使之游离出来，便于测定药物或代谢药物的总浓度,体内样品介质组成复杂，干扰很多，而待测药物组分浓度很低，进行预处理可以分离浓集样品。,防止仪器的污染、劣化，提高测定的灵敏度和选择性。不同的仪器及分析方法对样品有不同的要求，须处理。,Company Logo,常用体内样品预处理方法,去除蛋白质方法,分离与富集方法,微透析技术,缀合物水解,化学衍生化,萃取,如何进行？,Company Logo,有机破坏(硝酸-高氯酸消化),P181,P185,溶解剂法(硝酸-高氯酸消化
9、),常用体内样品预处理方法,Company Logo,去除蛋白质方法,加入与水混融（亲水性）的有机溶剂（乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃）。溶液的介电常数下降，蛋白质分子间静电力增加而聚集；亲水性溶剂使蛋白质水化膜脱落而析出沉降，并使与蛋白质以氢键及其它分子间作用力结合的药物析释放出来。,溶剂沉淀法,混比1：23，冷冻离心,Company Logo,去除蛋白质方法,混比1：2，冷冻离心,加入中性盐(饱和硫酸铵、硫酸钠、枸橼酸盐)，使溶液的离子强度发生变化，部分蛋白质的电性被中和，蛋白质的分子间排斥力减弱而凝聚；同时中性盐使蛋白质水化膜脱落而析出沉降。,中性盐析法,Company Logo,去除蛋白质
10、方法,混比1：0.6，冷冻离心,加入强酸(10%三氯醋酸、6%高氯酸等)，影响蛋白质等电点及开成不溶性盐而沉降。,强酸沉降法,Company Logo,去除蛋白质方法,热变性蛋白质离心,煮鸡蛋？,热凝固法,Company Logo,（1）优点：与杂质分离 简便 浓集提取率高（2）提取率：在有机相与水相中的溶解度的比值分配系数，一般少量多次，对生物样品一般一次萃取，70%重现性,分离与浓集,液液萃取LLE,利用药物在有机溶剂中的溶解度大于在水中的溶解度而提取,Company Logo,（3）影响提取率的因素 pH 碱性药物在碱性pH 酸性 酸性pH 提取溶剂 相似相溶原理 沸点低，不影响检测,性
11、质稳定，不起化学反应(化学惰性）离子强度 加入中性盐 增加离子强度，与水结合强，便于有机溶剂提取,分离与浓集,Company Logo,对于离子性特强，水溶性极大的药物，可采用离子对提取原理应用阴离子：COOH+SO3H-反离子 四丁基铵阳离子：NH2+反离子烷基或芳基磺酸盐提取溶剂用量:一般在试管中进行 有机相与水相比1:1到5:1,分离与浓集,Company Logo,分离与浓集,固相萃取SPE,是目前使用相当广泛的一种萃取方法，惜乎价格较贵,将不同填料作为固定相装入小柱，药物溶液通过小柱时，药物被吸附、分配、离子交换，或其它亲和力作用，使药物及内源性物质同时被保留在固定相上，再选用适当溶
12、剂洗脱药物的方法,这方面，美国是老大,Company Logo,用有机溶剂(甲醇)冲洗洗净,用水冲洗活化,上样,用水或缓冲液冲洗，洗去内源性物质,有机溶剂洗脱药物收集洗脱液,固相萃取步骤,Company Logo,方法好价格贵,Company Logo,固相选择 样品1ml 1ml规格固相 125ml 3ml规格固相固相处理 反相C18 固定相的610倍体积甲醇洗柱，使溶剂化 610倍水缓冲服液冲洗达分离状态上样分离 用适当的弱溶剂洗涤 洗去杂质，通N2干燥固相洗脱待测物 改变pH或极性,固相萃取具体步骤,Company Logo,（1）流速 流速快，按触不充分，样品流失 回收率低 柱处理 5
13、10mlmin-1 洗脱 0.21mlmin-1（300mg 25mlmin-1（300mg）（2）装样 过载 突破性试验 已知浓度样品液 小体积上柱洗脱回收百分率 加大体积洗脱回收百分率 绘图 当回收率下降时为过载,固相萃取具体步骤,Company Logo,超滤分离法,是以多孔半透膜（超滤膜）作为分离介质的一种膜分离技术，选用不同的孔径的不对称膜，即可按照分子量大小进行分离,适合TDM血样分析,Therapeutic drug monitoring,Company Logo,缀合物的水解,酶水解法,酸水解法,溶剂解法,book,Company Logo,化学衍生法,why?,某些药物或者代
14、谢产物极性大，挥发性低，或者对检测器不够灵敏，难以满足常规HPLC及GC检测的需要，因此进行衍生,How for GC?,硅烷化,酰化,烷基化,不对称化,Company Logo,化学衍生法,why?,某些药物或者代谢产物极性大，挥发性低，或者对检测器不够灵敏，难以满足常规HPLC及GC检测的需要，因此进行衍生,How for LC?,UV,FL,非对映衍生化,?,Company Logo,化学衍生法,非对映衍生化,?,对映体：一个化合物的两个光学异构体，其分子在整体上互为不能重叠的镜像。分子量、分子式完全相同。应用普通色谱方法难以分离。通过衍生可以使之非对映化。根据构象等理化性质差异进行分离
15、。,Company Logo,分析方法的建立,方法的选择,Chromatography？,immunoassay？,biology？,Company Logo,分析方法的建立,方法建立的程序,条件筛选？,条件优化？,实际样品测试？,Company Logo,分析方法的建立,方法的验证,特异性,标准曲线与定量范围,定量下限,准确度与精密度,稳定性,回收率,分析过程的质量控制,未知样品浓度超出范围的处理,相关物质测定,其它方法验证,Company Logo,第四节 体内样品分析方法与方法验证,(一)、特异性 所测的物质是原型药物或特定的活性代谢物，内源性物质和响应的其他代谢物及其他药物不影响样品的
16、测定。,Company Logo,第四节 体内样品分析方法与方法验证,(二)、标准曲线与线性范围,Y=9.56610-2X+6.15310-3 r=0.9995,至少6个浓度点建立标准曲线线性范围必须覆盖全部待测浓度，不得外推最低浓度点偏差在20%其余浓度点的偏差在 15%。,Company Logo,(三)精密度与准确度(四)定量下限(五)稳定性(六)提取回收率(七)质控样品(八)质量控制(九)测定结果,第四节 体内样品分析方法与方法验证,看书了解,Company Logo,色谱条件优化,试剂与溶剂实验,经化学衍生化处理时要进行此步试验,取待测药物的非生物介质溶液（通常为水溶液），按拟定的分
17、析方法进行衍生化反应，萃取，分离等样品预处理后，进样分析以考察反应试剂对测定的干扰，通过条件优化，使空白试剂色谱峰不干扰药物的测定,Company Logo,相关术语,生物介质,来源于生物的介质，如全血，血浆，血清，尿，粪，各种组织等,取空白生物介质按照拟定的体内样品预处理与分析方法进行操作。,生物介质实验,色谱条件优化,Company Logo,相关术语,取空白生物介质按照拟定的体内样品预处理与分析方法进行操作。,生物介质实验,目的：用于考察生物介质中的内源性物质对测定的的干扰情况。,要求：在待测药物，特定的活性代谢产物，内标物质等的信号窗口不应出现内源性物质信号,色谱条件优化,Compan
18、y Logo,色谱条件优化,标准物品？,在空白生物介质中加入已知量的待测物标准物质制成的样品,主要用于建立标准曲线，计算质控样品和未知样品的浓度,Company Logo,色谱条件优化,质控样品试验,取空白生物介质，按实际体内样品中药物的预期浓度范围，加入待测药物的标准物质制成标准样品和质控样品，照生物介质试验项下的方法进行实验，建立分析方法的定量范围与标准曲线并进行方法学考察,标准物品？,质控样品？,Company Logo,色谱条件优化,即QC样品，系指在空白生物介质中加入已知量待测药物标准物质制成的样品,质控样品？,主要用于监测生物分析方法的效能和评价每一分析批结果的完整性和正确性,Co
19、mpany Logo,色谱条件优化,标准物品？,质控样品？,相同点,制备方法完全一样,Company Logo,色谱条件优化,标准物品？,质控样品？,不同点,应用目的不一样,Company Logo,色谱条件优化,标准物品？,质控样品？,具体操作,做标准曲线，及相关指标考察,在分析样品时，每分析多少个样品进行一次质控样品分析，看分析方法的可靠性：控制分析质量,Company Logo,色谱条件优化,具体操作,实际样品测试,就是实际样品测试，类似于供试品测试；考察方法是否适合于实际样品的测试,Company Logo,色谱条件优化,介质效应,样品存在除待测物质以外的所有其它干扰物质对响应造成的直
20、接或者间接影响,质控样品池,所有的质控样品，同未知样品在相同条件下保存测试,Company Logo,色谱条件优化,未知样品,研究样品，作为分析对象的体内样品,制备样品,待测样品经过各步骤（如提取、纯化、浓缩等）处理制成的、直接用于仪器分析的试样,Company Logo,色谱条件优化,分析批,包括未知样品、适当数量的标准样品和QC样品的完整系列,Company Logo,液相色谱技术简介,讲述原因,同学们对液相色谱的相关理论认知不深，感觉抽象，给本课程学习带来严重影响,在本书中有大量的含量测定及杂质限量方法会用到液相色谱方法,希望给同学们今后从事药物分析工作，读研、读博从事药学研究提供一定的
21、帮助,Company Logo,液相色谱技术简介,液相色谱定义,Company Logo,液相色谱技术简介,气、液相色谱区别,Company Logo,液相色谱技术简介,液相色谱的结构与原理,Company Logo,液相色谱技术简介,液相色谱的结构,高压输液系统,分离系统,检测系统,进样系统,Company Logo,液相色谱技术简介,液相色谱的分离系统,Company Logo,液相色谱技术简介,液相色谱的基本概念,固定相：固定相是色谱的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶
22、解，交换等作用。流动相：在色谱过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱色谱中一般称为洗脱剂，薄层色谱时称为展层剂。,Company Logo,分配系数 可由Langmuir方程得出 Kd-分配系数 q、c-溶质在固相和液相中的浓度,Company Logo,保留时间（tR）和保留体积（VR）反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一。,Company Logo,分离度:又称分辨率，用来表示两种洗脱曲线相邻的溶质相互分离的程度。,两个相邻洗脱峰之间的距离与两个峰宽的代数平均值.,Company Logo,理论板，理论板当量高度（HET
23、P），理论塔板数（N）、反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系。理论板：将溶质达到一次分配平衡的色谱柱段。理论板当量高度：该段色谱柱的高度。,Company Logo,理论板数的计算方法,N-理论塔板数 tR-保留时间W1/2-半峰宽 Wb-峰底宽度,理论塔板高度：,L-柱长,Company Logo,液相色谱技术简介,液相色谱的检测系统,介绍,Company Logo,种质中心Waters HPLC仪器全图,由图可以看出，HPLC仪器排出了大量的有毒废液，而这些实验室的废液是直接经下水道排到环境中去的，造成大量污染,Company Logo,Waters HPLC仪器分离检测单元图,由图可以看出HPLC仪器需要大量的有毒流动相,Company Logo,Agilent HPLC色谱仪器,Agilent HPLC仪器使用的废液瓶，这些废液并没有专门的处理方法,Company Logo,Waters HPLC仪器内部结构,Waters仪器内部结构，右边内部是真空脱气机，外边是比例阀，右边是泵和单向阀，管路众多，结构复杂,Company Logo,Waters仪器的分离通道,Waters仪器的样品分离通道，上面是色谱柱，下面是一个小的预柱,Company Logo,开尔文探针显微镜描述单个分子里的“电荷分布”图片,
