药物分析课件第4章药物定量分析与分析方法验证.ppt

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1、第四章 药物定量分析与分析方法验证,第一节 定量分析样品的前处理方法,第二节 定量分析方法特点,第三节 药品质量标准分析方法验证,第四节 生物样品分析方法的基本要求,返回主目录,基本要求,练习与思考,基本要求,一、掌握定量分析方法验证的效能指标。二、熟悉定量分析样品的前处理方法。三、了解定量分析样品的前处理方法的进展 及在药物分中的应用。,返 回,第一节 定量分析样品的前处理方法 一、概述 1.为什么要对定量分析的样品进行前处理？含卤素有机药物 R-X（F，Cl,Br,I）金属有机药物 R-O-Me（有机酸或酚的 含金属有机药物 金属盐；结合不牢固）有机金属药物 R-Me（结合牢固）2.常用的

2、处理方法 不经有机破坏的分析方法 药物分析中常用的分析方法 经有机破坏的分析方法,二、不经有机破坏的分析方法（一）直接测定法 例如：富马酸亚铁 溶于热稀矿酸，采用铈量法，邻二氮菲作指示剂,（二）经水解后测定法 1.直接回流后测定法 例如：三氯叔丁醇的含量测定 CCl3-C(CH3)2-OH+4NaOH(CH3)2CO+3NaCl+HCOONa+2H2O NaCl+AgNO3 AgCl+NaNO3 AgNO3+NH4SCN AgSCN+NH4NO3 2.用硫酸水解后测定法 例如：硬脂酸镁的含量测定 Mg(C17H35COO)2+H2SO4 MgSO4+2C17H35COOH H2SO4+2NaO

3、H Na2SO4+2H2O,（三）经氧化还原后测定法 1.碱性还原后测定 例如：泛影酸的含量测定 2.酸性还原后测定 例如：碘番酸的含量测定 Zn还原 后银量法,3.利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量（1）含锑药物 例如：葡萄糖酸锑的含量测定 Sb5+2KI Sb3+2K+I2 I2+2Na2S2O3 2NaI+Na2S4O6（2）含铁药物 2Fe3+2KI 2Fe2+2K+I2 I2+2Na2S2O3 2NaI+Na2S4O6,H+,三、经有机破坏的分析方法 湿法破坏 药物分析中常用的有机破坏的方法有 干法破坏 HNO3-HClO4法 氧瓶燃烧法(一)湿法破坏 HNO3-H2SO4法

4、 H2SO4-硫酸盐法 HNO3-H2SO4-HClO4法；H2SO4-H2O2；H2SO4-KMnO4(二)干法破坏 加Na2CO3或MgO以助灰化；温度控制在420,(三)氧燃瓶燃烧法(oxygen flask combustion method)1.仪器装置 500ml,1000ml,2000ml,磨口、硬质玻璃锥形瓶 2.称样 固体样；液体样要求详见P68 3.燃烧分解操作法 4.吸收液的选择 用于X、S、Se等的鉴别、检查、含量测定时 多数是H2O或H2O-NaOH；少数为H2O-NaOH-H2O2.,应用示例：碘苯酯的测定,返 回,第二节 定量分析方法特点,一、容量分析法（一）容量

5、分析法的特点 操作简单、快速；比较准确（RSD0.2%）；仪器普通易得。,（二）容量分析法的计算问题 1.滴定度（T）的概念 每1mlmol溶液相当于被测物质的量(mg)2.滴定度的计算 aA+bB cC+dD T=Mb/aB 3.百分含量的计算（1）直接滴定法 D%=V F T/W 100%F=实际标定的浓度/规定的浓度（2）间接滴定法（回滴定法；剩余滴定法）D%=（VO VB)F T/W 100%,二、光谱分析法（一）紫外-可见分光光度法（200nm760nm)灵敏度高，可达10-4g/ml 10-7g/ml 1.特点 准确度高，SRD（%）为2%5%仪器价格低廉，操作简单，易普及，应用

6、范围广。2.朗伯-比耳定律 A=ECL E1%1cm=10/M,3.仪器校正和检定 波长校正用汞灯中较强谱线237.38,253.65,275.28,296.73,313.16,334.15,365.02,404.66,425.83,546.07nm与576.96nm 或用仪器中氘灯的486.02nm与656.10nm进行校正。吸收度的检定：用K2CrO7(60mg)+0.005mol/LH2SO4液至1000ml 波长(nm)235(最小)257(最大)313(最小)350(最大)E1%1cm 124.5 144.0 48.62 106.6 杂散光检查：试剂 浓度(g/ml)测定波长 透光率

7、(%)NaI 1.00 220nm 0.8 NaNO2 5.00 340nm 0.8,4.对溶剂的要求:220240nm 241250nm 251300nm 300nm以上 溶剂+吸收池A 0.41 0.20 0.10 0.05 5.测定方法 要求供试品溶液的A应在0.3 0.7 对照品比较法：Cx=(Ax/Ar)Cr;含量%=CxD/W100%常用方法 吸收系数法：含量%=(E1%1cm)x/(E1%1cm)r 100%计算分光光度法：VA的三点校正法,（二）荧光分光光度法 灵敏度高，可达10-10g/ml 10-12g/ml 在低浓度进行测定，防止F与C不成正比及自熄灭作用 1.特点 用基

8、准物溶液校正仪器灵敏度，防止样品液荧光衰减 灵敏度高，但干扰因素多。制备荧光衍生物，可提高其灵敏度和选择性。用样品量少，操作简单，方法快速，应用范围较广。,2.荧光分析仪 有二个单色光器激发单色光器与发射单色光 器；且激发光源、样品池和检测器成直角。,3.含量测定 常用的方法对照品比较法:Ci=(Ri-Rib)/(Rr-Rrb)Cr Ch.P收载地高辛片、利血平片、洋地黄毒苷片。,三、色谱分析法 按分离原理分为：吸附；分配；离子交换；排阻色谱 方法分类 按分离方法分为：PC；TLC；柱色谱；GC；HPLC。（一）HPLC法 1.对HPLC仪器一般要求 色谱柱、流动相按品种项下要求。色谱柱的理论

9、板数：n=5.54(tR/Wh/2)2 2.系统性试验 分离度：R=2（tR1 tR2)/(W1+W2);要大于1.5 拖尾因子：T=W0.05h/2d1 应在0.9 1.05,内标法加校正因子测定供试品中主成分含量3.测定方法 标准曲线法 外标法测定供试品中主成分含量 外标一点法,应用示例：RP-HPLC法测定盐酸黄酮哌酯片含量，用标准曲线法 如头孢拉丁；头孢羟氨苄；头孢唑啉钠用外标一点法,（二）GC法 1.对GC仪器一般要求 载气为氮气；色谱柱为填充或毛细管柱 色谱柱的理论板数：n=5.54(tR/Wh/2)2 2.系统性试验 分离度：R=2（tR1 tR2)/(W1+W2);要大于1.5

10、 拖尾因子：T=W0.05h/2d1 应在0.9 1.05,内标法加校正因子测定供试品中主成分含量 3.测定方法 标准曲线法 外标法测定供试品中主成分含量 外标一点法 应用示例：Ch.P(2000)收载的月桂卓酮、维生素E及其片剂、注 射剂、甲酚皂溶液等均采用GC法中的内标法加校正 因子测定含量。,返 回,第三节 药品质量标准分析方法验证 一、准确度 是指用该方法测定结果与真实值接近的程度，用回收率表示（一）含量测定方法的准确度 1.原料药 可用已知纯度对照品或样品进行测定；或与已建准确 度的另一方法测定的结果进行比较。2.制剂 要考察辅料对回收率的影响。采用在空白辅料中加入原 料对照品的方法

11、作回收率试验，然后计算RSD。具体做法：测定高、中、低三个浓度，n=3,共9个数据来评价 回收率的RSD2%；用UV和HPLC发时，一般回 收率可达98%102%；容量法可达99.7%100.3%,（二）数据要求 回收率%=（测定平均值 空白值）/加入量100%要求制备高、中、低三浓度的样品，各测定3次。应报告已知加入量的回收率，或测定结果平均值与真实值之差及其可信限。,二、精密度 是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次测定结果 之间的接近程度。（一）精密度表示方法 1.偏差(deviation,d)d=测得值-平均值=Xi-X 2.标准偏差（standard deviation,SD

12、或S）S=(Xi X)2/(n-1)1/2 3.相对标准差(relative standard deviation,RSD)也称变异系数(coefficient of variation,CV)RSD=标准偏差/平均值100%=S/X 100%,（二）重复性、中间精密度及重现性,1.重复性 在相同条件下,由一个分析人员测定所得结果的精密度.2.中间精密度 在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不 同设备测定结果的精密度。3.重现性 在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度。,（三）数据要求 应报告S或SD、RSD和可信限。用统计学的可信性分析(t或f）。,三、专属性 是指在其他成分(如杂质

13、、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检 查、含量测定方法，均应考察其专属性。（一）鉴别反应 应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分 的样品均应呈现负反应。,（二）含量测定和杂质测定 色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。在能 获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。在杂 质和降解物不能获得的情况下，可用以验证方法和药典方法进 行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比较两种方法。,四、检测限（limit of detection,LOD)是指试样中被测物能被检测出的最

14、低浓度或量，是限度检验 指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。（一）常用的方法 1.非仪器分析目视法 用已知浓度被测物，试验出能被可靠地 检测出的最低浓度或量。2.仪器分析方法 UV法：LOD=f.3S空=C样/A样 3S空 Flu法：LOD=f.3S空=C样/(F样-F空)3S空 GC和HPLC法：LOD=S/N=2或3,（二）数据要求 应附测试图，说明测试过程和检测限结果。,五、定量限（limit of quantitation,LOQ)是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应 具一定准确度和精密度。杂质和降解产物进行定量测定时，要求 LOQ.常用信噪比法确定

15、定量限，一般以S/N=10时相应的浓度进行 测定。,六、线性 是指在设定的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接 呈正比关系的程度。UV法：首先制备一个标准系列，浓度点n=5;A=0.3.0.7 建立回归方程C=aA+b;r 0.9999。HPLC法：制备一个标准系列，浓度点n=5 7;以C对h或A或与 内标物的峰面积之比，建立回归方程r 0.9999。,七、范围 是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限度或量的区间。,原料药和制剂含量测定：范围应为测试浓度的80%-120%。制剂含量均匀度检查：范围应为测试浓度的70%-130%。溶出度或释放度中的溶出量测定：范围应为限度的20

16、%。,八、耐用性 是指在测定条件下有效的变动时，测定结果不受影响的承受 程度。典型的变动因素有：被溶液的稳定性、样品提取次数、时 间等。HPLC法变动因素有：流动相组成与pH，色谱柱，柱温，流速等。GC法变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检 测器温度等。,分析方法效能指标的具体应用：1.用于鉴别试验的方法：只要求专属性、耐用性，其余不要求。2.用于原料药中杂质测定和制剂中降解产物测定的方法：用于定量：除了检测限不要求外，其余七项指标均要求。限度检查：除检测限、专属性、耐用性要求外，其余不要求。3.原料、制剂及溶出度测定：不要求检测和定量限，其余均要求。,返 回,第四节 生物样品分

17、析方法的基本要求 一、常用样品的种类、采集和贮张 二、生物样品分析前处理技术 三、定量分析方法验证,返 回,练习与思考,A型题,1 药品的鉴别是证明 A未知药物的真伪 B已知药物的真伪 C已知药物的疗效 D药物的纯度 E药物的稳定性,2相对标准差表示的应是A准确度 B回收率 C精密度 D纯净度 E限度,3用移液管量取的25ml溶液，应记成A25ml B25.0ml C25.00ml D25.000ml E251ml4以下三个数字0.5362、0.0014、0.25之和应为A0.79 B0.788 C0.787 D0.7876 E0.8,5表示两变量指标A与C之间线性相关程度常用A相关规律 B比

18、例常数 C相关常数 D相关系数 E精密度6减小偶然误差的方法是A做空白试验 B做对照实验 C做回收试验 D增加平行测定次数 E选用多种测定方法,B型题,14A1.23 B1.22 C2.54 D2.53 E2.5111.225222.535132.534842.5068,A,C,D,E,58A空白试验 B对照试验 C回收试验 D鉴别试验 E检测试验5以同量的溶剂替代供试品同法进行测定试验6在供试液中加入已知量的标准物或已知量的被测物后，同法进行测定试验7用已知量的纯物质作为试样，同法进行测定试验8取少许水杨酸，加水溶解，加三氯化铁试液，显紫堇色,A,C,D,B,X型题,1药物分析方法的效能指标

19、有 A检测限 B耐用性 C准确度 D专属性 E代表性2对药物中杂质进行检查时，要求所用的检查方法应具有 A耐用性 B专属性 C检测限 D准确度 E线性与范围,3用碘量法测定维生素C原料药时，要求碘量法应具备 A专属性 B定量限 C精密度 D粗放度 E线性4系统误差来源于 A分析方法 B所用试剂 C操作者 D所用仪器 E工作环境,5消除系统误差的方法为 A校正所用的仪器 B作对照实验 C做空白试验 D做预试验 E做回收试验6以下所列仪器哪些使用前需进行校正 A滴定管 B量瓶 C量杯 D移液管 E碘量瓶,7中国药典（2000年版）在正文部分的检查项下应包括 A药物的真伪 B有效性 C均一性 D纯度要求 E安全性8进行药品检验时，要从大量样品中取出少量样品应考虑取样的 A多样性 B真实性 C代表性 D科学性 E可靠性,9用信噪比表示检测限时，信噪比一般应为 A11 B21 C31 D41 E5110检验报告应有以下内容 A供试品名称 B外观性状 C检验结果、结论 D送检人盖章 E报告的日期,返 回,