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1、2023/8/24,2023/8/24,四 类药型评价,利用计算机辅助药物设计系统得到的化合物，除了在化学上要求易于合成以外，还应该关注溶解性、代谢稳定性和安全性性质，即设计的药物应具有优良的ADME（吸收、分布、代谢、排泄等）特性，这些性质与药物和“类药性”分子的要求一致。类药性（drug-like property）代表了理想化药物所具有的特点，是药物所表现出来的理化性质和结构特征在体内的综合反映(包括药动学性质和毒性)。简单来讲就是和已知的药物分子所具有的相似性。一般认为化合物所表现出的结构和理化性质应与体内药动学参数具有良好的相关性，并能够满足该化合物口服途径，获得理想的吸收、分布、代
2、谢和排泄要求。此外还应该具有易合成性和市场可接受性等特点。,2023/8/24,2023/8/24,类药性的判断方法,排除法模版法直接性质预测法,2023/8/24,2023/8/24,1、排除法,所谓的排除法就是参考已知的经验，排除那些可能导致毒性、生物利用度低下或者其它不适宜作为药物的性质。利平斯基规则 已知不合适官能团排除法 其它法则,2023/8/24,2023/8/24,利平斯基规则,利平斯基（Lipinsk）规则，又称Ro5规则，是一个被广泛认知和接受的类药性过滤方法，也有人称其为类药性5规则。该规则是考虑到要使设计的化合物具有较好的生物利用度，药物分子必须能够穿透细胞膜，因此以分
3、子是否具有良好的膜渗透性来作为过滤的条件。Ro5 规则认为，一个化合物如果违背了下述规则中的任意两条，就很难被生物体所吸收：分子量小于500；氢键给体（OH或NH）小于或等于5；氢键受体小于10；logP小于5。,2023/8/24,2023/8/24,已知不合适官能团排除法,某些具有潜在诱变性和致癌性的官能团，如在第二章谈到的毒性基团，或者在代谢过程中不稳定易产生毒性的基团一般被认为不具有类药性，而应该严格控制。另外，具有活性官能团的化合物，可以与蛋白质作用，在体外产生假阳性或毒性，不再具有类药性而应该尽可能的避免。这种筛选方法不需要特殊的计算法则，只需要根据普通的医药化学知识和个人的经验确
4、定。,2023/8/24,2023/8/24,其它法则,又很多相应的规则，如：药物的物理性质的类药分子通用规则 分子量在160480之间，平均为357；logP 在-0.45.6之间，平均2.52；摩尔折射率40130之间，平均97；原子数在2070之间，平均48；分子中必须同时具有以下几种官能团中一部分：苯环、杂环、脂肪胺（最好是叔胺）、羧基、酰胺、醇羟基、羧酸酯、酮基等。,2023/8/24,2023/8/24,基于PSA的类药性规则 该规则考虑了分子的柔性，要得到具有大于20%40%的生物利用度，化合物分子必须满足：PSA小于或等于140 2（或者氢键供体和氢键受体数小于或等于12），该
5、条件与极化基团渗透细胞膜的去溶剂化能有关；可旋转的化学键小于或等于10，PSA（极化表面积极化原子的范德华表面积之和）是与膜渗透相关的另一个参数，研究表明，口服吸收的PSA上限为1401502，穿透血脑屏障的PSA不超过90 2，,2023/8/24,2023/8/24,药效团类药性法则：一个类药性分子起码有两个以上的药效点，但也不能多于7个；基本药效点包括胺、氨基化合物、醇、酮、砜、磺胺、羧酸、氨基甲酸、胍、脒、脲和酯等，并且药效点的杂原子间应被一个以上的碳原子所分隔，否则只算做一个药效点，同环的多个氨基只能算一个药效点，吡咯、吲哚、噻唑等不算药效团；具有一个以上的羧基的化合物是非类药性分子
6、，无环结构的化合物一般为非类药性分子。,2023/8/24,2023/8/24,2、模版法,与排除法相反，模版法是利用已知药物结构的有用特征对设计的化合物进行评价，有很多相应的方法，如优先结构法、人工智能分类法等。,2023/8/24,2023/8/24,优先结构法,所谓的优先结构指的是可以和相应受体和酶紧密结合的特征结构类型，优先结构可来源于已知药物，也可以来自于天然产物，一般是紧密的杂环、多环体系，在指定的三维空间中可以诱导出不同的替代模式 优先结构的内涵已经扩展到药物分子中经常发现的结构片段，目前已经有了商业化的片段库，可以在数据库中提取优先的子结构。32个基本分子构架就包括了所有分子的
7、50%,其中最常见的结构是六元环,2023/8/24,2023/8/24,人工智能分类法,模版法虽可提供明确的指导，但并不能使涵盖的所有分子具有类药性。模仿认知机制的人工神经智能网络被用于药物识别模式，通过检验药物可能的内在特性（如原子类型、LogP、分子量等）来区分药物和非药物（不具有类药性）。,2023/8/24,2023/8/24,3、直接性质预测,由于类药性的概念非常模糊，而一个化合物能否成为一个药物，与化合物的许多性质相关联，这些性质中只有一部分是依赖于结构的，因此基于化学结构的类药性预测当然也存在着这样或那样的问题。先导化合物优化中遇到的问题和类药性问题实际上是相同的，即减少毒性、
8、提高溶解性，增加生物利用度、改善血脑屏障穿透能力和增加代谢稳定性等。,2023/8/24,2023/8/24,溶解性,药物作用的所有阶段都与溶解性密切相关，但溶解性又是一种很复杂的现象，很难被准确的预测。溶解性与化合物的亲脂性、和溶液之间形成的氢键数、分子内的氢键数、官能团的离子化程度以及晶体的特征（特别是结晶形态和能量）等因素有关。有一种利用标准回归统计的方法可以用于溶解度和其他物理性质的计算，这种方法基于对整体分子的物理描述，包括溶剂可及表面积、Lennard-Jones作用能、氢键给体和受体数目、氨基和硝基的数目等进行计算。,2023/8/24,2023/8/24,口服利用度,即口服剂量
9、中能到达血液循环部分的比例，它也与各种因素有关，包括药物的溶解性、化学稳定性和代谢稳定性、膜渗透性等膜的渗透率与极性表面区域和亲脂性等因素有关，现在已经有一些有效的预测膜渗透性的统计模型可以利用。,2023/8/24,2023/8/24,血脑屏障穿透,与膜渗透相似，血脑屏障穿透率与药物的亲脂性系数（logP）、氢键数目、离子化程度、分子大小以及柔性等有关有人提出一个简单的QSAR方程来用于计算药物在脑中和血液中的比率：log（c脑/c血）=-0.0148PSA+0.152ClogP+0.139,2023/8/24,2023/8/24,代谢稳定性,至今为止，虽然有许多软件可以进行预测代谢稳定性，
10、但仍没有特别可靠的方法进行预测，MetabolExpert 和META等程序可以预测化合物的代谢途径，但是又难以说明产生这些代谢的可能性有多少。,2023/8/24,2023/8/24,毒性,化合物产生毒性的原因很多，包括药物与DNA或者蛋白质作用，或干扰了酶系统等。相应的毒理学数据库如RTECS（含10万个以上的化合物数据）和TOXSYS（24万个化合物数据）可以参考基于专家系统的计算也可预测化合物毒性，这些系统包含了那些具有潜在产生毒性的结构片段，如基于规则的DEREK和HazardExpert、ToxAlert等以及基于系统的QSAR-TOPKAT和CASETOX等。,2023/8/24
11、,2023/8/24,存在问题,类药性规则定义不确切，难以适用于所有体系。应考虑类药性规则的使用环境，而不能不加区别的使用，如一个长时间服用的中枢神经系统药物和一个仅需要短期使用快速奇效的静脉注射药物就需要使用不同的规则加以判断。各种分类方法均没有反映出已知药物的特性，并妨碍新的结构类型药物的发现；分类方法使用了已知的药物相应的数据库，因而所得到的结果可信度依赖于数据库的完整性。,2023/8/24,2023/8/24,结论,合理药物设计-药物设计的发展方向计算机辅助药物设计的发展趋势,2023/8/24,The Principle of Drug Design第六章,六、新药研究中的基因技术
12、,基因技术及基因药物的发展,基因技术方法,与基因有关的药物设计,2023/8/24,基因技术是一系列有关研究基因结构和功能的方法之一，是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和行使正常功能（称之为“表达”），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术，描述这些方法的术语包括“DNA重组技术”、“基因工程”、“基因拼接”等。,一、什么是基因技术,6-1 基因技术及基因药物的发展,2023/8/24,1利用基因工程技术可以获得天然来源难以得到的生理活性物质，并可提供足量的生物活性物质以进行结构、功能、性质等方面的研究，使之成为新药，并避免由于免疫
13、抗原性等原因而带来的副作用。2.利用基因工程技术可以向生物环境中引入能编码目的蛋白质的基因，这种蛋白质可再此环境中被大量的生产。例如使某些活性蛋白、多肽基因在微生物、细胞以及动物、植物反应器中得到高效表达，使许多难以得到的生物活性物质如胰岛素、干扰素等批量生产。,基因技术的优点,2023/8/24,3利用基因工程技术可不断发掘和开发更多的新型生理活性物质。例如红细胞生长素（EPO）、神经生长因子（NGF）等。4.利用基因工程技术可以改造内源性活性物质，对蛋白质的特异位置进行修饰，可以改变氨基酸的序列，在编码基因中引入特异的突变体，从而改变其物理化学性质，提高其生物活性、减少副作用如将组织纤溶酶
14、原激活剂tPA分子重组缩小后，半衰期明显延长，注射一次即可溶栓。,2023/8/24,5通过基因重组技术，能够获得新的化合物（包括自然界不存在的化合物），扩大药物来源，这正是制药工业引进基因工程的主要原因之一。,2023/8/24,1973年,美国斯坦福大学医学院Prof.Coben及其研究小组把大肠杆菌质粒DNA酶切后插入抗四环素基因,组成一个可在大肠杆菌种复制,并表达出具有抗四环素及大肠杆菌质粒DNA双抗遗传表型的重组子,第一次的基因重组,2023/8/24,日新月异的生物技术不断推动着这场革命，生物工程药物将成为21世纪药业的支柱。与生物制药直接相关的最新领域包括；组合化学（combin
15、atorial chemistry）、药学基因（pharmacogenomics）、蛋白组学（proteomics）、蛋白治疗（gene therapy）、功能抗原学（functional antigenics）、生物信息学（bioinformatics）、高通量筛选（high-throughput screenign）和众所周知的基因组学（genomics，包括后基因组学）等。,基因药物是多学科共同发展的结晶,2023/8/24,一 基本知识二 基因技术的一般介绍重组蛋白的表达,6-2 基因技术方法,2023/8/24,一、基本知识,Nucleic Acid,2023/8/24,染色体上具有
16、遗传作用的是脱氧核糖核酸即DNA。DNA链由两条碱基互补的脱氧核苷酸链反向平行旋转形成双螺旋结构。每个脱氧核苷酸由一个碱基、一个脱氧核糖及一个磷酸分子组成。碱基的不同决定了脱氧核苷酸种类的不同。DNA中的碱基种类有四种：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）。基因是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。基因是带有遗传性状的DNA片段，每个基因具有自身的遗传密码。基因决定着蛋白质的合成，有“一个基因一个多肽链”的说法。基因决定蛋白质，蛋白质决定代谢作用，代谢作用决定各种性状。,、基因的化学本质,2023/8/24,1、核酸的分类和组成,核酸分为
17、两大类.脱氧核糖核酸（DNA）Deoxyribonucleic Acid核糖核酸（RNA）Ribonucleic Acid。,核酸的分类,核酸,2023/8/24,DNA分子含有生物物种的所有遗传信息，分子量一般都很大。DNA为双链分子，其中大多数是链状结构大分子，也有少部分呈环状结构。,脱氧核糖核酸（DNA）,核酸,2023/8/24,核糖核酸（RNA）,RNA的功能与特征RNA主要是负责DNA遗传信息的翻译和表达，分子量要比DNA小得多。RNA为单链分子。RNA的类别根据RNA的功能，可以分为mRNA、tRNA和rRNA三种。,核酸,2023/8/24,2、核酸的结构,核酸的一级结构多聚核
18、苷酸是由四种不同的核苷酸单元按特定的顺序组合而成的线性结构聚合物，因此，它具有一定的核苷酸顺序，即碱基顺序。核酸的碱基顺序是核酸的一级结构。DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于DNA分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。而mRNA(信息RNA)的碱基顺序，则直接为蛋白质的氨基酸编码，并决定蛋白质的氨基酸顺序。,2023/8/24,RNA一级结构的特点,RNA一级结构研究最多的是tRNA、rRNA以及一些小分子的RNA。其中tRNA分子具有以下特点：分子量25000左右，大约由7090个核苷酸组成，沉降系数为4S左右。分子中含有较多的修饰成分。3-末端都
19、具有CpCpAOH的结构。,核酸,2023/8/24,mRNA一级结构的特点,真核细胞mRNA的3-末端有一段长达200个核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，称为“尾结构”，5-末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为”帽结构“。,核酸,2023/8/24,核酸的高级结构特点,RNARNA是单链分子，因此，在RNA分子中，并不遵守碱基种类的数量比例关系，即分子中的嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基的总数。RNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结构，不能形成双螺旋的部分，则形成突环。这种结构可以形象地称为“发夹型”结构。,核酸,2023/8/24,tRNA的高级结构,1，tRNA的二级结构tRNA的二级结构都呈
20、”三叶草”形状，在结构上具有某些共同之处，一般可将其分为五臂四环：包括氨基酸接受区、反密码区、二氢尿嘧啶区、TC区和可变区。除了氨基酸接受区外，其余每个区均含有一个突环和一个臂。,核酸,2023/8/24,(1)氨基酸接受区包含有tRNA的3-末端和5-末端，3-末端的最后3个核苷酸残基都是CCA，A为核苷。氨基酸可与其成酯，该区在蛋白质合成中起携带氨基酸的作用。(2)反密码区与氨基酸接受区相对的一般含有7个核苷酸残基的区域，其中正中的3个核苷酸残基称为反密码,核酸结构,2023/8/24,二氢尿嘧啶区该区含有二氢尿嘧啶。TC区 该区与二氢尿嘧啶区相对，假尿嘧啶核苷胸腺嘧啶核糖核苷环(TC)由
21、7个核苷酸组成，通过由5对碱基组成的双螺旋区(TC臂)与tRNA的其余部分相连。除个别例外，几乎所有tBNA在此环中都含有TC。可变区位于反密码区与TC区之间，不同的tRNA该区变化较大。,2023/8/24,DNADNA的二级结构,1953年，J.Watson和F.Crick 在前人研究工作的基础上，根据DNA结晶的X-衍射图谱和分子模型，提出了著名的DNA双螺旋结构模型，并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。,核酸,2023/8/24,DNA双螺旋结构的特点,DNA分子由两条DNA单链组成。DNA的双螺旋结构是分子中两条DNA单链之间基团相互识别和作用的结果。双螺旋结构是DNA二级结
22、构的最基本形式。,核酸,2023/8/24,DNA双螺旋结构的要点,（1）DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为53，而另一条链的方向为35。,2023/8/24,（2）嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成90角。,DNA双螺旋结构的要点,2023/8/24,（3）螺旋横截面的直径约为2 nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为3.4 nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈）高度为34 nm
23、。,DNA双螺旋结构的要点,2023/8/24,DNA双螺旋的稳定性,DNA双螺旋结构在生理条件下是很稳定的。维持这种稳定性的因素包括：两条DNA链之间形成的氢键；由于双螺旋结构内部形成的疏水区，消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响；介质中的阳离子（如Na+、K+和Mg2+）中和了磷酸基团的负电荷，降低了DNA链之间的排斥力、范德华引力等。改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳定性。,2023/8/24,核酸的三级结构,在三叶草型二级结构的基础上，突环上未配对的碱基由于整个分子的扭曲而配成对，目前已知的tRNA的三级结构均为倒L型,核酸,2023/8/24,核酸,2023/8/24,核酸,
24、2023/8/24,基因的定义 基因是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。基因是决定一条多肽链的DNA片段。分类 根据其功能把基因分为三类编码蛋白质的基因，它具有转录和翻译功能，包括编码酶和结构蛋白的结构基因以及编码阻遏蛋白的调节基因；只有转录功能而没有翻译功能的基因，包括tRNA基因和rRNA基因；不转录的基因，它对基因表达起调节控制作用，包括启动基因和操纵基因。启动基因和操纵基因有时被统称为控制基因。,（三）基因概念,2023/8/24,基因的结构,2023/8/24,2023/8/24,2023/8/24,中心法则,生物的遗传信息从 DNA传递给 mR
25、NA的过程称为转录。根据 mRNA链上的遗传信息合成蛋 白质的过程，被称为翻译和 表达。1958年Crick将生物 遗传信息的这种传递方式称为中心法则。,2023/8/24,转录过程,2023/8/24,翻译过程,2023/8/24,基因的转录 mRNA的合成,基因转录是以DNA为模板合成与其碱基顺序互补的mRNA的过程。细胞生长周期的某个阶段，DNA双螺旋解开成为转录模板，在RNA聚合酶催化下，合成mRNA。mRNA不能自我复制，即其本身不能作为复制模板，因此在转录过程中即使出现某些差错，也不会遗传下去。,2023/8/24,mRNA 是DNA的转录本，携带有合成蛋白质的全部信息。蛋白质的生
26、物合成实际上是以mRNA作为模板进行的。,2023/8/24,遗传密码,mRNA分子中所存储的蛋白质合成信息，是由组成它的四种碱基（A、G、C和U）以特定顺序排列成三个一组的三联体代表的，即每三个碱基代表一个氨基酸信息。这种代表遗传信息的三联体称为密码子，或三联体密码子。因此 mRNA 分子的碱基顺序即表示了所合成蛋白质的氨基酸顺序。mRNA的每一个密码子代表一个氨基酸。20种基本氨基酸的三联体密码子都已经确定。此外，还有一个密码子是肽链合成起始密码子,三个是终止密码子，以保证蛋白质合成能够有序地进行。,2023/8/24,遗传密码,2023/8/24,、基因技术的特征及研究内容 基因工程的基
27、本方法总结 基本的DNA克隆技术 PCR技术,二 基因技术的一般介绍,2023/8/24,、基因技术的特征及研究内容,1、基因工程的定义基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为克隆）和行使正常功能（称之为表达），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。,2023/8/24,基因工程是专指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）与载体系统（病毒、细菌质粒或噬菌体）的DNA结合成一个复制子
28、。复制子所在的宿主生物或细胞中复制，继而通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子，无性繁殖使之成为克隆。直接利用转化子，或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达体系，使重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物。,2023/8/24,基因工程中内外源DNA插入载体分子所形成的杂合分子又称为嵌合DNA或DNA嵌合体（DNA chimera）。构建这类重组体分子的过程，即对重组体分子的无性繁殖过程又称为分子克隆（molecular cloning），基因克隆（gene cloning）或重组 DNA（recombinant DNA）。,2023/8/24,2、基因工程的特征,基因工程有两个重要
29、的特征：可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的其他受体细胞中，因此可以实现按照人们的愿望，改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状；某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供了可能，拓宽了分子生物学的研究领域。,2023/8/24,3、基因工程的研究内容基因工程的研究内容主要包括：从复杂的生物体基因组中采用鸟枪克隆法、人工合成法等方法分离并获得带有目的基因的DNA片段；在体外将含目的基因的DNA片段和具有自我复制功能、并带有选择性标记的载体分子进行酶切连接，获得重组DNA分子；利用特定的方法将重组DNA分子转移至适当受体细胞（寄主细胞），并与其同步增殖；从大量的细胞繁
30、殖群体中，筛选出克隆有重组DNA分子的寄主细胞；将目的基因克隆至适当的表达载体，采用特定的方法将基因导入受体细胞，使其在新的遗传背景下获得活性表达，从而得到需要的特定目的物质。,2023/8/24,基因工程流程模式图,2023/8/24,、基因技术在药物研究中的基本方法,基因技术可将已知编码蛋白基因导入生物环境并使蛋白能够被大量的表达，同时还可以改变蛋白特定位置上的氨基酸的位置，既可以对氨基酸个点位置、也可以使编码蛋白基因中特定位置的突变等。具体的方法包括基因重组技术，如cDNA的克隆、PCR扩增等；重组蛋白的表达，表达宿主包括大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、转基因动物等；新型蛋白质
31、设计，新设计的蛋白包括天然蛋白质的变异物、不同蛋白质结构域的嵌合物等。,2023/8/24,、基因技术中常用的工具酶,基因工程使用的每一种工具酶都具有自身特定的功能。有的像“手术刀”（限制性核酸内切酶），可以进行DNA分子的特定切割；有的像“粘合剂”（DNA连接酶），可以促进DNA分子之间的粘合和连接；有的像“砌砖机”，可以合成完整的双链DNA分子。其他基因工程常用的工具酶，还有末端转移酶、单链核酸酶和反转录酶等。,2023/8/24,限制性内切酶(Restriction Endonuclease)简称限制酶，能够识别DNA大分子链上特定的核苷酸顺序，并能在某一特定部位将DNA断裂。这样，目的
32、基因便有可能完整地存在于某一DNA片段上，然后再把它们分离出来。在基因工程中，限制酶是进行DNA分子切割的特殊工具,具有“分子剪刀”或“分子手术刀”之称。已经发现的限制酶多达20多种。每一种都有极强的特异性，可以准确无误地进行核苷酸的识别，,1、限制性核酸内切酶,2023/8/24,根据限制性核酸内切酶在识别和切割序列方面的特性（切割位点）、分子量的大小、酶蛋白的结构、催化条件（反应所需的辅助因子等）和修饰活性，将限制酶分为I、三类，然而在基因克隆中具有实用价值的只有类限制酶。类限制酶的特性 识别特点 不同的限制酶对DNA识别序列是不同的，多数限制酶能够识别有48个碱基对组成的特定核苷酸序列，
33、识别位点的一个共同特征是核苷酸顺序通常呈双重旋转对称结构，即回文序列，如EcoRI为5-GAATTC-3（较严格而独特的识别序列），Hae I 为（序列中某些部位可有灵活性），,2023/8/24,切割方式 切割位点相对于双对称轴的位置而言，可有两种不同的切割方式：一种是在识别序列对称轴两侧相同的位置分别切割DNA，得到粘性末端（cohesive end，简称粘端）；地二种是在对称轴处同时切割DNA双链，产生具有平端（blum end）的DNA片段（,2023/8/24,同裂酶与同尾酶 虽然来源不同但是能够识别相同的核苷酸序列，并且切割方式也相同限制酶称之为同裂酶；将那些虽然来源不同，识别序列
34、和切割方式都不同、但切割后可产生相似的粘性末端的限制酶称为同尾酶。末端的连接 同一种酶或者不同的酶经梅切后产生的匹配粘端可在连接酶作用下直接进行连接，这是DNA重组最常用的方法。虽然平度也可以直接连接，但是效率较低。此外不匹配粘端在经过一定的修饰后，也可以进行连接。影响限制酶活性的因素 影响限制酶的活性的因素很多，包括DNA的纯度、钩型、甲基化程度以及缓冲溶液的选择、反应温度（多数最佳温度为37，也有些不是）、酶的活性、用量、反应速率（酶切时间）等。,2023/8/24,2、DNA连接酶能催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键,它要求一条DNA的3末端有一条游离羟基,并且在另一条DNA链的5末端有
35、一个有一个磷酸基团。并且它只能连接双螺旋的DNA分子，而不能连接单链的或者环化的单链DNA分子。3、其它的酶 除上述的酶以外，在基因工程中还经常用到能够以DNA或者RNA为模版，在体外合成DNA 的DNA聚合酶。比较重要的包括大肠杆菌DNA聚合酶I、klenow酶、T噬菌体DNA聚合酶等；DNA聚合酶、测序酶、逆转录酶、末端转移酶、核酸修饰酶等。,2023/8/24,生物具有很强的排他性，目的基因很难进入不同种属的细胞中，即使能够进入细胞中，叶不能进行复制和繁殖，它必须与具有自我复制能力的DNA共价结合后才能被复制，这种具有在细胞内进行自我复制的DNA分子就是外源基因的运载体。在基因技术中，基
36、因运载体（vector）的设计与应用是一个重要环节。,运载体,2023/8/24,1、运载体的类型 运载基因的载体作媒介物是必要的经常使用的载体，目前用于基因制药的基因运载体主要包括：质粒环状双链小型 DNA 分子，种类甚多，有的可在细菌细胞内独立复制，有的亦可用于动、植物细胞。例如：根瘤土壤杆菌所携带的 Ti 质粒常用作植物细胞基因工程的载体。人工改造的质粒常用的有pBR322天然质粒，派生质粒pmB1，psC101等；噬菌体常用的是噬菌体，经构建后，常用于细菌细胞。此外还有Mu噬菌体载体等；病毒例如猿猴空泡病毒 SV40 常用作动物细胞基因工程的载体；粘粒（cosmid，装配性质粒），由质
37、粒和Mu噬菌体的cos位点或膜等构建而成的一种大容量克隆载体等。不同的载体，分子量大小、结构和用途上存在着较大的差异,2023/8/24,2、作为运载体的条件,用于基因克隆载体的理想质粒应能够满足：具有复制起始点，即具有复制子功能，且复制起始区中没有所需的限制酶切位点，并可维持使每个细胞含有一定的质粒拷贝数，一般，一个质粒只含有一个复制起始点，构成一个独立的复制子。具有两个易被检测的选择形标记，一个理想的质粒克隆载体应具有两种抗生素抗性基因，以便为寄主细胞提供易于检测的选择形标记。具有多种限制酶的单一识别位点，适用于各种限制酶产生的DNA片段的插入，以满足基因克隆的需要，在插入适当大小的外源D
38、NA片段后，应该不影响质粒DNA的复制功能。应具有尽可能小的分子量，以利于分离纯化等条件,2023/8/24,3、载体的共性,能在受体细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。在其DNA插人外源基因后，仍然保持稳定的复制状态和遗传特性；易于从宿主细胞中分离，并进行纯化；在其DNA序列中，具有适当的限制性内切酶位点。这些位点位于DNA复制的非必需区内，可在这些位点上插人外源DNA，但不影响载体自身DNA的复制；,2023/8/24,基因工程的原料就是目的基因。所谓目的基因，是指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或DNA片段，能编码某一产物或某一性状。目前获取目的基因的方法主要有三种：反向转录
39、法从细胞基因组直接分离法人工合成法。,、目的基因的获取,2023/8/24,（1）反向转录法：主要用于分子量较大而又不知其序列的基因.以目的基因的mRNA为模板，借助反转录酶合成碱基互补的DNA片段，即cDNA，再在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA，亦即目的基因的双链DNA。,2023/8/24,（2）从细胞基因组中直接分离：包括两个主要步骤：基因文库组建提取细胞的整体DNA，用内切酶或其它方法将完整的双链DNA分子随机切割成适当长度的片段，得到的DNA片段群的某一片段上可能刚好有所需要的目的基因；然后把这些片段连接到合适的基因载体上，引入受体细胞中进行分子克隆，即进行目的基因的增殖。测定
40、所有含有重组DNA的克隆的个数，插入的染色体DNA片段的长度，加以统计处理，计算出克隆里包含的某物种染色体DNA遗传信息量的概率。如果库内所有的重组DNA克隆上的染色体 DNA已经代表了这个物种遗传信息量的 95以上，那么这个基因文库就建成了。,2023/8/24,检索挑选含有特定目的基因的单一受体细胞。利用某种检测方法 根据重组克隆株明显的表型变化，通过直接观察挑选 利用核酸探针，直接检测细胞内的目的基因。核酸探针是用放射性同位素或其他标记物标记的DNA片段，具有非常特异的序列，能与互补链结合，因此用它可以进行特定基因的检测。用鸟枪法分离目的基因，具有简单、方便和经济等优点。许多病毒和原核生
41、物、一些真核生物的基因，都用这种方法获得了成功的分离。,2023/8/24,（3）人工合成：依照某一蛋白质的氨基酸序列，即可按密码子推算出其基因的核苷酸序列，随后应用化学合成法，就可在短时间内合成目的基因,2023/8/24,（1）获取目的基因 即用各种不同的方法取得人所需要的基因，也就是某些DNA片段。那里面含有一种或几种遗传信息的全套遗传密码。获取目的基因是基因工程操作的关键。（2）获取基因载体 用人工方法，取得目的基因的适宜的载体，即质粒或病毒。载体一般带有必要的标志基因，以便进行检测。,基因工程的基本方法总结,2023/8/24,(3)重组DNA 即用人工方法，让目的基因与运载体相结合
42、，首先要用限制性内切酶和其他一些酶类，切割或修饰载体DNA和目的基因，然后用连接酶将两者连接起来，使目的基因插入载体内，形成重组DNA分子。这些工作都在生物体外进行，所以基因工程操作又叫体外DNA重组。（4）把重组DNA导入受体细胞进行扩增 即用人工方法，让携带着目的基因的运载体进入新的生物细胞里，让其增殖，由此形成重组DNA的无性生殖系（即克隆）。（5）筛选与培育 即基因表达产物的鉴定、收集和加工等一系列复杂过程的综合。,2023/8/24,基因工程操作流程图,2023/8/24,其他相关技术,1、PCR技术多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种依
43、赖于特异DNA序列的体外酶促扩增技术在试管中有DNA模版、引物和含有四种不同碱基的脱氧核糖核苷酸的合适缓冲液中，DNA聚合酶催化DNA合成的往复循环，体系中含有短的DNA引物和几种脱氧核苷酸混合物，其中一条引物与cDNA未尾结合另一引物与cDNA的互补链另一端结合，反应的结果使模版DNA被大量的扩增，反应往返循环下去就使靶序列大大扩增，理论上每循环一次，就使产物在前一循环的基础上翻一倍，依次下去，经过2530个循环后，最初的靶序列就可扩增105109倍。,2023/8/24,2、生物芯片技术.生物芯片是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术。主要是指通过微加工技术和微电子技术在固格体
44、芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA 以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。,2023/8/24,6-3 与基因有关的药物设计,一、核酸的作用基础二、以核酸为靶点的药物设计三、基因突变、基因重组与药物设计,2023/8/24,一、核酸的作用基础,基因的研究已经深入到许多领域，但研究的基础却可以用一个模型、一个法则和四个概念来简述：一个模型：1953年由Watson和Crick提出的DNA的双螺旋模型，基因研究的结构基础；一个法则：基因表达的中心法则指的是生物的遗传信息从 DNA传递给mRNA的过程称为转录。根据mRNA链上的遗传信息合成蛋白质的过程，被称为翻
45、译和表达。四个概念：复制（replication）、转录（transcription）、翻译(translation)和密码子(codon),2023/8/24,中心法则,DNA复制与生物遗传信息的保持在复制开始阶段，DNA的双螺旋拆分成两条单链。以DNA单链为模板，按照碱基互补配对的原则,在DNA聚合酶催化下，合成与模板DNA完全互补的新链，并形成一个新的DNA分子。通过DNA复制形成的新DNA分子,与原来的DNA分子完全相同。经过一个 复制周期后，子代DNA分子的两条链中，一条来自亲代DNA分子，另一条是新合成的，所以又称为半保留复制。,2023/8/24,1、DNA的复制与生物遗传信息的
46、保持DNA复制的要点是：1）在复制开始阶段，DNA的双螺旋拆分成两条单链。,2023/8/24,2）以DNA单链为模板，按照碱基互补配对的原则,在DNA聚合酶催化下，合成与模板DNA完全互补的新链，并形成一个新的DNA分子。,2023/8/24,3)通过DNA复制形成的新DNA分子,与原来的DNA分子完全相同。经过一个 复制周期后，子代DNA分子的两条链中，一条来自亲代DNA分子，另一条是新合成的，所以又称为半保留复制。,2023/8/24,DNA复制过程,2023/8/24,2、RNA与生物遗传信息的表达 首先，DNA通过转录作用，将其所携带的遗传信息（基因）传递给 mRNA,在三种 RNA
47、（mRNA、tRNA和rRNA）的共同作用下，完成蛋白质的合成。,2023/8/24,RNA与生物遗传信息的表达,首先，DNA通过转录作用，将其所携带的遗传信息（基因）传递给 mRNA,在三种 RNA（mRNA、tRNA和rRNA）的共同作用下，完成蛋白质的合成。,2023/8/24,二、以核酸为靶点的药物设计,研究表明，中心法则不仅适用于正常的基因的复制、转录和翻译等，某些疾病的产生也遵循中心法则。因此，药物的设计既可以以蛋白质为靶点，同样也可以以核酸为靶点。以核酸为靶点的药物研究主要从下面两个方面进行的：阻断疾病基因的表达 基因表达调控理论的发展，肿瘤基因的表达也遵循中心法则。在复制、转录
48、、翻译等环节中对肿瘤、病毒等基因的表达进行阻断是可能的。调整或关闭导致疾病产生的酶和受体的合成 按照中心法则，所有的蛋白酶、受体的合成都受制于DNA、RNA的编码和组织。以核酸为靶点的药物设计可以通过抑制有害蛋白的合成而将疾病阻断在早期阶段。是关闭或调整某些不正常酶或受体合成的有效途径。在药物设计中对核酸的分子识别非常重要。,2023/8/24,目前，以核酸为靶点的药物设计主要集中在反义核酸（anti-sense nucleic acid）酶性核酸(核酶，ribozyme)的设计小分子与核酸的相互作用其它,2023/8/24,、反义核酸技术,反义核酸（包括asRNA和asDNA）是以选择性抑制
49、特定基因为目的，根据碱基配对原则、核酸杂交原理等设计的一类新的核酸。反义核酸技术主要包括反义RNA（asRNA）和反义DNA（asDNA）等两种类型，反义核酸可用化学方法合成，也可以利用载体来携带编码的反义RNA，再将表达载体导入细胞内。该技术可以根据已知序列基因设计出特异性的干扰其表达的药物，在抗病毒和抗肿瘤药物研究方面具有重要的意义。,2023/8/24,其中asRNA是能与靶分子mRNA序列互补的RNA片断，通过碱基对间氢键的作用与靶mRNA形成双链复合物而影响基因的转录、翻译和加工过程，从而调控基因的表达。从作用机制来看，asRNA属于负调控机制，可在生物体内进行多层次的控制，如抑制质
50、粒的复制、调节细菌内质粒的拷贝数、在转录和翻译水平上调控基因的表达，,2023/8/24,asDNA是一段人工合成的能与特定基因某一区域互补的正常或经过修饰的寡聚脱氧核苷酸（oligo deoxy nucleotide，ODN)或其化学修饰物，长度一般在20个碱基左右，能够封闭或抑制该基因的表达。,2023/8/24,核酸的杂交,热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。DNA单链与互补的RNA链之间也可以发生杂交。核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。,
