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1、,菌种的保藏和管理 杜平华,菌种保藏的重要性,菌种保藏是微生物检验工作中的一项常规技术 科学保藏和管理关系到检验结果的正确性.,菌种的2015版指导原则,原则：应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。,使用菌种来源,菌种编号 2015版 CMCC 中国医学菌种保藏中心 CMCC（F）真菌 CMCC（B）细菌 协调案 ATCC 美国标准菌种收藏中心 NCIMB 英国食品工业与海洋菌种保藏中心 NBRC 日本技术评价研究所生物资源中心 CIP 法国巴斯德研究所菌种保藏中心,菌种保藏的中心任务,-广泛收集。-选择最适宜的保藏方法，保持菌种的生物学
2、特性。,常用菌种的保藏,菌种保藏的原则 根据微生物菌种的生理、生化特性，尽量降低微生物细胞的代谢强度，处于休眠状态，以减低菌种的变异率。,常用菌种的保藏2015指导原则,试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代）。采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。冷冻保藏：在低温下保藏，一般在低于-30或-70，是有效的长期储藏方法。冻干法保藏：是一种长期保藏菌种的方法法。冷藏：在28保藏，是短期储藏方法。,菌种的保藏,低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都可以抑制微生物的代谢和生长繁殖，因此低温、干燥和真空是菌种保藏的重要手段。,菌种的保藏,工作菌
3、株不可代替标准菌株，标准菌株的商业衍生物仅可用作 工作菌株。,标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株。冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后,不得重新冷冻或再 次使用。,菌种的保藏,不同的微生物，应根据其生物特征来选择最适宜的保藏方法：挑选特征典型的纯菌菌落 确定保藏的合适菌体形态 选择最适宜的方法保藏 定期检查,菌种的保藏,琼脂斜面低温保藏法,液体冷冻保藏法,制备方法1%蛋白胨、甘油,灭菌,接种、培养18-24小时.保存条件-80可保存数年.,菌种的传代和使用,工作菌种传代次数不得超过5代。1代 是指将活的培养物接种到新鲜培养基中，任何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次。,基本操作
4、技术,细菌的接种、分离和培养 接种：将微生物的培养物接种到培养基上的一种操作技术。接种：斜面培养基 半固体培养基 液体培养基 平板培养基,分离技术,将细菌分离成单个细胞，使其独立分裂繁殖形成单个菌落的操作技术。方法 平板划线-分段划线、连续划线 涂布分离法 倾注分离法等,培养,接种后的培养基，根据不同微生物生长条件的要求，培养基放在适宜 微生物生长的环境中温度、湿度、氧气等），使其生长繁殖的过程。需气菌培养法:厌氧培养法 嗜温性微生物：1545。嗜热性微生物：45以上。嗜冷性微生物：15以下。,培养后微生物的生长判断固体培养基 有菌落生长或沿穿刺线扩散生长。液体培养基 浑浊、菌膜、沉淀等。,菌
5、种的传代和使用,冻干菌种（0代）增菌培养 苏醒（1代）增菌培养 复壮（2代）分装冷冻保存 斜面培养基 划线传代（3代）使用 分装冷冻保存 斜面培养基 划线传代（4代）使用 分装冷冻保存 斜面培养基 划线传代（5代）使用 分装冷冻保存。,斜面培养物1 3环 适宜液体培养基510ml，培养1824h 取适 当量，用灭菌生理盐水稀释后比浊（或预实验）按比浊结果或预实验将菌液稀释到相应倍数 平板计数(取上述稀释液1ml加入平皿中加入 规定培养基、培养、点计菌落数 实验、阳性对照 平板计数也可和试验同时进行,菌液的制备和使用,菌液制备用培养基2015修订内容,菌液制备用培养基2015修订内容,菌液制备用
6、稀释液2015修定内容,菌液贮存2015修定内容,修订前 修订后 菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8，可在24小时内使用。稳定的黑曲孢子悬液可保存在2-8，在验证过的贮存期内使用。,菌种的鉴定与复壮,菌种的衰退 由自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。控制菌种的衰退方法-控制传代次数 降低突变几率，采用良好的传代保藏方法。-创造适宜的培养条件：-用不同类型的细胞进行传代-采用有效的保藏方法 定期检查,菌种的复壮采用分离纯化的方法。形态特征、生理生化特征、代谢产物、血清学等一系列试验鉴定，证明复壮后的菌种与原种完全一致。,菌种的鉴定与复壮,微生物鉴定系统是基于
7、不同的分析方法，其局限性与方法和数据库的局限性有关。微生物鉴定需通过已建立的标准微生物如模式菌株的特征(基因型和/或表型)相匹配来完成。否则将得不到鉴定的结果.明确鉴定系统局限性和需要的鉴定水平(属、种、型)。,菌种的鉴定,鉴定方法传统方法 增菌分离(纯菌)确认试验(菌落形态、革兰染色、显微镜下菌体形态、生化特性及血清学检查)。依据 伯杰士细菌鉴定手册重要的生化试验氧化酶试验 革兰氏阴性菌、非发酵的棒状细菌+肠道菌-过氧化氢酶试验 葡萄球菌+链球菌-凝固酶试验+葡萄球菌可能为致病菌以上信息对大部分类型的生产环境中的微生物的调查及日常分析，已可提供足够的信息。2015版-指导原则,菌种的鉴定,纯
8、菌的分离 微生物的表型表型微生物鉴定通过长时间培养对微生物细胞的恢复、增殖是有限的，如有些环境中的微生物在普通微生物增殖培养基不能恢复。此外，分离出的受损的培养物可能不能完整表达其表型属性。基因型微生物鉴定,菌种的鉴定,微生物分类中使用的表型特征分类 特征培养物 菌落形态学、菌落颜色、形状、大小和产色素形态学 细胞形态学、细胞大小、细胞形状、鞭毛类型、内容 物、革兰氏染色、芽孢和抗酸染色、孢子形成模式生理学 氧气耐受性、pH范围、最适温度和范围、耐盐性生化反应 碳源的利用、碳水化合物的氧化或发酵、酶的模式抑制性 胆盐耐受性、抗生素敏感性、染料耐受性血清学 凝集反应、荧光抗体化学分类 脂肪酸构成
9、、微生物毒素、全细胞组分 生态学微 生物来源,菌种的鉴定,保藏环境 冷藏或冷冻保存。专用的冰箱，上锁。专人保管 按操作规程和有关要求进行保管鉴定,或定期更换冻 干菌种。发现污染和变异现象，立即报告、处理。,菌种的管理,菌种的管理,使用菌种的单位，应具备从事微生物工作的条件和设备。菌种应由专人负责管理。管理人员应具有微生物专业知识和技术水平，并应具有较 强的责任心。,菌种的管理,实验室必须建立菌种保存和使用文件化的程序管理制度；朔源性 贮藏 标准菌株工作菌株转种 传代定期鉴定（纯度、特性）培养基和培养条件、保存位置和条件等。其它 使用及销毁的记录等。详细记录,菌种的管理,-菌种不得随意带出实验室，外单位索取、购买应有证明和登记，并包装严密。-菌种处理应严格按操作规程进行，灭菌处理应有详细记录。,谢谢,
