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1、1,第二节 原核生物DNA复制,特点只有一个复制起始点双向复制复制速度快引物和冈崎片段长可以连续发动复制,2,大肠杆菌DNA聚合酶三类DNA聚合酶-多功能酶,5-3,DNA聚合酶的功能,53聚合作用53外切酶35外切酶活性,功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补，切除引物。,DNApol 利用35外切活性切除错配的碱基，同时利用53聚合活性补回正确的核苷酸，这种功能称为即时校读(proof read)。,DNApol 的53外切酶作用可以与其聚合作用同时发生，产生缺口平移(nick translation)、链的置换及模板转辙现象。,DNApol的即时校读功能,323个
2、氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,5 ucgagcuag-OH 3,5 ucgagcuag,53聚合作用,3 agctcgatcgtagcctagcgtagcagtgcacgatc 5,3 agctcgatcgtagcctagcgtagcagtgcacgatc 5,catcggatcgcatcgtcacgtgctag 3,5,3,内切酶,外切酶,外切酶与内切酶作用图解,53外切酶活性的功能,切除引物，切除突变
3、片段,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,?,能切除突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,DNA聚合酶的核酸外切酶活性,35 外切酶活性,DNA-pol（120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然 能存活。它参与DNA损伤的应急状态修复。,功能：原核生物复制延长中真正起催化作用的酶,DNA-pol(250kD),10种亚基组成的不对称异源二聚体,可滑动的 夹持器亚基,催化亚基,35外切酶亚基,前导链 合成,后随链 合成,夹持器装置,催化亚基,亚基保持核心酶 的二聚体结构,亚基具有53方向合成DNA的催化活性亚基具有35外切酶活性，起校对功能，可提高聚合酶复制DN
4、A的保真性 亚基可能加强亚基的作用亚基犹如夹子，功能是识别引物、夹住DNA 分子向前滑动 亚基起着促使核心酶二聚化的作用其余的亚基构成-复合物，主要功能是帮助 亚基夹住DNA（也称夹子装置器），并有 增强核心酶活性的作用,大肠杆菌三种DNA聚合酶比较,DNA聚合酶,分子量每个细胞的分子统计数5-3 聚合酶作用3-5 核酸外切酶作用5-3 核酸外切酶作用转化率主要功能活性（nt/min）,DNA聚合酶,DNA聚合酶（复合物）,109，000400+1校读,修复1000,120，00040+-0.05,400，00010-20+50复制100000,特 性,不清填补缺口50,17,大肠杆菌基因组D
5、NA 复制的基本过程起始起始部位的解链,oriC,DnaA蛋白结合9bp序列,13bp重复序列区解链,单链结合蛋白结合,形成开放复合物,18,局部形成引发体DnaC、B、G和起始点DNA形成复合物，其蛋白质部分在链上移动到合适位置，根据碱基配对的原则，开始催化RNA引物的合成,19,复制的延伸半不连续-前导链的连续合成，随从链合成一段段冈崎片段,20,复制的终止,oriC,终止序列,复制叉终止区,终止序列,缠绕的环状DNA分子,拓扑异构酶II,独立的环状DNA分子,21,原核生物基因组DNA复制的典型模式型复制-复制从oriC开始以顺时针和逆时针两个方向进行主要的复制方式,22,原核生物DNA
6、复制的调节复制起始频率的调节主要调节复制的起始频率DnaA的浓度对复制的起始具有正调控 作用复制频率与细胞分裂周期相适应的机制控制复制起始点的甲基化修饰,亲代单链A甲基化,DNA与细胞膜结合，DNA的甲基化受到抑制,Ori C中的GATC,Dam,Seq A,子代DNA中的A被甲基化,Dam,24,第三节 真核生物DNA复制,1.真核生物染色体DNA 复制的共同特点复制时要解开和重新合成核小体结构A.复制速度慢于原核生物克服核小体结构 的空间阻碍B.组蛋白合成与DNA复制同步进行，使DNA边复制，边组装成核小体,25,2.多起点复制3.RNA引物片段及冈崎片段长度小于原核生物4.真核生物染色体
7、复制完成后在再进行下一次的复制,26,真核生物染色体DNA 复制过程复制的聚合酶和辅助因子五种、分别起着不同的作用,真核生物的DNA聚合酶,28,复制的起始和终止起始复制起始点-自主复制序列，能被起始复合物识别,酵母复制起始点的结构,B3,B2,B1,A,复制起始识别序列,ARS结合因子1结合位点,解链区段,起始识别复合物,ARS结合结合因子1,DNA聚合酶与负责的延伸,DNA聚合酶：RNA引物的合成，新的DNA链合成。DNA聚合酶：取代DNA聚合酶，是DNA复制延长的主要酶，这个过程称为聚合酶的切换。PNCA:增值细胞核抗原，可以与DNA聚合酶结合，增强其延伸能力。,30,端粒结构和端粒酶在
8、真核生物基因组复制过程中的作用端粒-真核，由DNA和蛋白质组成生物染色体的末段结构端粒酶-逆转录酶，蛋白质和RNA组成，其RNA序列是复制端粒重复序列的模板，具有种属特异性,31,32,端粒结构是保持真核染色体DNA在复制过程中DNA的长度,保证染色体的稳定性.端粒DNA的长度变短可以导致细胞活性下降，细胞衰老；端粒酶活性过高，端粒DNA不停的延长，细胞不停分裂，有可能产生癌症。,33,线粒体DNA的复制D环复制方式模板双链的复制起点激活有先后，复制的结束时间不同,34,35,真核生物DNA复制的调控细胞周期过程中的调控在S 期进行染色体的双向复制,DNA合成期,哺乳动物的细胞周期,37,真核
9、生物DNA复制的调控细胞周期过程中的调控细胞周期蛋白D 激活S期的CDK 激活复制许可因子（其此时可以从细胞浆进入细胞核，然后失活）,38,染色体水平调控复制子水平的调控与复制起始复合物的形成和RNA引物的合成等的一些蛋白质和酶来共同参与复制起始位的调控,第四节 某些病毒基因组的复制,模板-RNA或DNA酶-聚合酶（RNA或DNA）、蛋白因子复制场所-大部分RNA病毒（逆转录以外）在细胞质中进行 大部分DNA病毒在细胞核中需要宿主提供复制的蛋白分子起始的引物多样性,避免5-end shortent,SSB+ATP DNA 末端解链,TP,3 OH,过程 NF NF DBP 首先结合到复制起点，
10、然后PTP前段蛋白与聚合酶形成复合物与DNA结合，催化DNA的末端解链。,腺病毒 DNA 复制起始,43,反转录病毒基因组的复制反(逆)转录酶-以RNA 为模板指导三磷酸脱氧核苷合成cDNA原料:dNTP 模板:正链RNA病毒引物:宿主细胞tRNA,逆转录酶是多功能酶，有三种酶活性：,1.逆转录活性：即以RNA为模板合成DNA,2.RNase活性：水解RNA:DNA中的RNA,3.DNA pol活性：以DNA为模板合成DNA,特点：无外切酶活性，转录错误率高210-4。,TTTT,poly A tail,CCC,3,5,3,GGG,整合入细胞基因组,逆转录活性,RNase活性,RNA:DNA杂合链,RNA模板,单链DNA,双链DNA,DNA pol活性,原病毒,tRNA提供3端羟基，与长末端序列（LTR）中的引物结合位点结合。,
