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1、生物化学,蛋白质结构与功能的关系蛋白质的性质及其应用,蛋白质结构与功能的关系,蛋白质的理化性质,蛋白质的分离、纯化与测定,1.4 蛋白质结构与功能的关系,一、蛋白质一级结构与功能的关系,一级结构是空间构象的基础,RNase是由124氨基酸残基组成的单肽链，分子中 8 个Cys的-SH构成4对二硫键，形成具有一定空间构象的蛋白质分子。在蛋白质变性剂（如8mol/L的尿素）和一些还原剂（如巯基乙醇）存在下，酶分子中的二硫键全部被还原，酶的空间结构破坏，肽链完全伸展，酶的催化活性完全丧失。当用透析的方法除去变性剂和巯基乙醇后，发现酶大部分活性恢复，所有的二硫键准确无误地恢复原来状态。若用其他的方法改
2、变分子中二硫键的配对方式，酶完全丧失活性。这个实验表明，蛋白质的一级结构决定它的空间结构，而特定的空间结构是蛋白质具有生物活性的保证。如下图：,2.蛋白质一级结构决定其高级结构，因此最终决定了蛋白质的功能。,84个氨基酸的胰岛素原（proinsulin），胰岛素原也没活性，在包装分泌时，A、B链之间的33个氨基酸残基被切除，才形成具有活性的胰岛素。如图所示:,猪胰岛素原激活成形成胰岛素示意图,胰岛素：AB两条链构成，A链含21个氨基酸残基，B链含 30 个氨基酸残基，链间有两对二硫键，A链上有一对二硫键。,3.功能相似的蛋白质往往能显似它们在进化上的亲缘关系：比较不同来源的细胞色素C发现，与功
3、能密切相关的氨基酸残基是高度保守的，这说明不同种属具有同一功能的蛋白质，在进化上来自相同的祖先，但存在种属差异。不同种属间的同源蛋白质一级结构上相对应的氨基酸差别越大，其亲缘关系愈远，反之，其亲缘关系愈近。,不同生物来源的细胞色素c中不变的AA残基,35个不变的AA残基，是Cyt C 的生物功能所不可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与“识别”并结合细胞色素还原酶和氧化酶。,血红蛋白的亚基与肌红蛋白一级结构中的保守氨基酸残基,许多疾病都是由于相关蛋白质结构异常引起的,基因突变导致蛋白质一级结构改变而产生的遗传病。称之为分子病。例如镰刀型贫血症，它是由于血红蛋
4、白的-亚基上的第六位氨基酸由谷氨酸变成了缬氨酸，导致血红蛋白的结构和功能的改变，其运输氧气的能力大大地降低，并且红细胞呈镰刀状。,正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图,所以，蛋白质一定的结构执行一定的功能。功能不同的蛋白质总是有着不同的序列；比较种属来源不同而功能相同的蛋白质的一级结构，可能有某些差异，但与功能相关的结构也总是相同。若一级结构变化，蛋白质的功能可能发生很大的变化。,二、蛋白质的空间结构与功能的关系,肌红蛋白（Mb）与血红蛋白的结构与功能：,肌红蛋白的结构,肌红蛋白的亚基铁卟啉,肌红蛋白的氧合曲线,Hb由4条肽链组成：2、2，功能是运载O2。在去氧Hb亚基中有下列几对离子键：,由
5、于血红蛋白亚基之间存在大量离子键，使其构象呈紧张态，对氧的亲和力很低，第一个亚基与O2结合时，离子键的破坏较难，所需要的能量较多。当血红蛋白的一个亚基结合氧之后引起它的构象从紧张态变成松弛态，其它的离子键也依次破坏，此时破坏离子键所需要的能量也少，构象的变化导致血红蛋白对氧的亲和力大大增强，因此第四个亚基结合氧的能力比第一个大几百倍。,血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线,上述Hb与O2结合后，Hb的构象发生变化，这类变化称为变构效应，即通过构象变化影响蛋白质的功能。像血红蛋白这种具有变构效应的蛋白质称为变构蛋白（allosteric protein）。血红蛋白的这种变构效应能更有效地行使其运氧的生物
6、学功能。,血红蛋白的变构效应使其有利于氧的运输,总之，各种蛋白质都有特定的空间构象，而特定的空间构象又与它们特定的生物学功能相适应，蛋白质的结构与功能是高度统一的。,1.5 蛋白质的理化性质及分离纯化,1、蛋白质的两性电离和等电点,蛋白质与氨基酸相似，也具有两性电离的性质。蛋白质的多肽链含有末端氨基和羧基，一些侧链上含有可解离的基团，有的可以接受氢离子，有的可以电离出氢离子，因此蛋白质具有酸碱两性电离的性质。它的两性电离比氨基酸复杂。对某一蛋白质而言，在某一pH下，当它所带正负电荷相等的时候，该溶液的pH就称为该蛋白质的等电点。蛋白质的等电点的大小与蛋白质的氨基酸组成有关。,蛋白质的性质及其应
7、用,2、蛋白质的高分子性质,蛋白质溶液有许多高分子溶液的性质，如：扩散慢、易沉降、粘度大、不能透过半透膜，在水溶液中可形成亲水的胶体。蛋白质胶体溶液的稳定因素：水化膜、带电荷。当破坏这两个因素时，蛋白质中从溶液中析出而产生沉淀。,透析,透析法：把混有小分子杂质的蛋白质样品溶液装在用玻璃纸，火棉纸等合成材料制成的半透膜透析袋里，然后放入流动的（或经常更换的）蒸馏水中，袋内的小分子杂质会不断扩散到半透膜外，直至完全排净，而蛋白质则留在袋内得到纯化。超滤法：是利用一种特制的半透膜，在外加强大压力作用下，迫使溶液中小分子透过而大分子则被阻留在滤膜之上而使之纯化。如：用(NH2)2SO4分级后的，需除去
8、(NH4)2SO4应采用上述两种方法之一即可。,3、蛋白质的沉淀作用,使蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀，方法有：,1）.盐析：在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸胺、氯化钠、硫酸钠等，使蛋白质从溶液中析出，称为蛋白质的盐析。而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。盐析的机理：破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使蛋白质产生变性。,2）.生物碱试剂沉淀法（条件：pH稍小于pI）生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生物碱试剂一般为弱酸性物质，如单
9、宁酸、苦味酸、三氯乙酸等。生物碱试剂沉淀蛋白质的机理：在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。“柿石症”的产生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的单宁酸，使肠胃中的蛋白质凝固变性而成为不能被消化的“柿石”。,3）.弱酸或弱碱沉淀法：用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH处于等电点处，使蛋白质沉淀。弱酸或弱碱沉淀法机理：破坏蛋白质表面净电荷。,4）.有机溶剂沉淀法：在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。有机溶剂沉淀法的机理：破坏蛋白质的水化膜。有机溶液沉淀蛋白质通常在低温条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变
10、性。,5）.重金属盐沉淀（条件：pH 稍大于pI为宜）：在蛋白质溶液中加入重金属盐溶液，会使蛋白质沉淀。重金属沉淀法的机理：重金属盐加入之后，与带负电的羧基结合。重金属沉淀蛋白质会使蛋白质产生变性，长期从事重金属作业的人应多吃高蛋白食品，以防止重金属离子被机体吸收后造成对机体的损害。,4、蛋白质的变性作用,1）.蛋白质变性的概念：天然蛋白质受物理或化学因素的影响后，空间构象发生变化，使其失去原有的生物活性，并伴随着物理化学性质的改变，这种作用称为蛋白质的变性。,2）.使蛋白质变性的因素a.物理因素：高温、高压、射线等 b.化学因素：强酸、强碱、重金属盐等,3）.变性的本质：分子中各种次级键断裂
11、，使其空间构象从紧密有序的 状态变成松散无序的状态，一级结构不破坏。,4).蛋白质变性后的表现：A 生物学活性消失B 理化性质改变：溶解度下降，粘度增加，紫外吸收增加，侧链反应增强，对酶的作用敏感，易被水解。,5、蛋白质的颜色反应,蛋白质的颜色反应主要与其定性、定量测定有关：a.茚三酮反应：多肽与蛋白质都能与之反应生成紫红色化合物。b.双缩脲反应：多肽与蛋白质都能和双缩脲试剂反应，随着肽键的数目越多，颜色依次为粉红、紫红、紫、蓝。c.酚试剂反应：多肽与蛋白质与酚试剂生成蓝色的化合物。另外，前面提到的氨基酸颜色反应蛋白质都具有。,双缩脲反应,Cu2+,(硷性溶液),红紫色络合物,蛋白质在碱性溶液
12、中也能与硫酸铜发生相同反应，产生红紫色络合物,6、蛋白质的紫外吸收特征,蛋白质溶液能在近紫外区（280nm处）有光吸收，主要是由带芳香环的氨基酸决定的。其对紫外光吸收能力的强弱顺序为：色（Trp）酪（Tyr）苯丙（Phe）。,1.6 蛋白质的分离纯化与测定,一、分离纯化蛋白质的意义,研究蛋白质的结构与功能：要求纯度高，不变性；提取活性的酶或蛋白质：必须保持天然活性状态；作为药物或食品添加剂：纯度要求一般。,二、蛋白质分离纯化的一般步骤,材料的选择原料的预处理蛋白质的抽提从抽提液中沉淀蛋白质纯化,蛋白质的分离纯化,1.原料的选择：要求含待分离的蛋白质丰富，廉价，易得，容易收集，新鲜无腐败。2.原
13、料的预处理：如果待分离蛋白质为胞外蛋白质，材料破碎后，用适当的溶剂直接抽提；若待分离蛋白质为胞内蛋白质，则需要破碎细胞膜，再用适当的溶剂抽提。3.从抽提液中沉淀蛋白质：常用盐析法、低温乙醇沉淀法、等电点沉淀法。,4、纯化：将沉淀的蛋白质溶解，再选择适当的纯化方法，得到纯度比较高的蛋白质溶液。纯化方法：电泳法、凝胶过滤法、离子交换层析、吸附层析法、亲和层析等。,（1）原材料预处理,凝胶层析,2）凝胶电泳法：,十二烷基磺酸钠（SDS）,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量1、蛋白质在各种介质中（PAGE）电泳时，它的迁移率,这样造成两个后果：SDS为阴离子，多
14、肽链覆盖上相同密度的负电荷超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。因此，所有SDS-蛋白质复合物，电泳时均以同样的电荷/蛋白质比向正极移 动。改变了蛋白质单体分子的构象。SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴直径均为1.8nm,长轴长度则随蛋白质的分子量而成正比例地变化。,3）离子交换层析,采用离子交换树脂 阳离子交换树脂 如：CM纤维素 阴离子交换树脂 如：DEAE纤维素（二乙基胺乙基纤维素）如：CM维生素：弱酸性物质 固定相：COO 交换相：H+PHPI时Pr+与H+交换吸附在树脂上，带正电荷较多的吸附强，带正电荷较少的吸附弱，用不同浓度的阳离子洗脱液。如：NaCl溶液进行梯度洗脱。通过Na+的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。,4）亲和层析,能被生物大分子所识别并于之结合的原子，原子团，和分子：酶-底物;激素-受体；抗原：抗体。原理：先把待提纯的某一蛋白质的特异配基，通过适当的化学反应共价的连接到像琼脂糖凝胶一类的载体表面的功能基上，在配基与多糖基质间迁入一个连接臂使配基于凝胶之间保持足够的距离，不改变载体表面的空间位阻妨碍等待分离的大分子与其配基的结合。,
