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1、第四章 血液及其成分的保存、运输和领发,全血在保存时会发生什么样的变化？全血保存主要需要解决哪些问题？,血液在贮存中的变化,(一)血浆的变化,三、血液在贮存中的变化,(一)全血的变化,血液在贮存中的变化,血小板,白细胞,5天之后逐渐死亡,24h之后功能逐渐丧失,血液在贮存中的变化,不稳定的凝血因子,活性逐渐下降,血液在贮存中的变化,红细胞,膜蛋白、脂质发生变化，钾离子降低，钠、钙离子升高。双凹形变成球形或桑椹形，脆性增加，易发性溶血。,三、血液在贮存中的变化,红细胞的变化,成熟红细胞不仅无细胞核，而且也无线粒体、核蛋白体等细胞器，不能进行核酸和蛋白质的生物合成，也不能进行有氧氧化，不能利用脂肪
2、酸。血糖是其唯一的能源。红细胞携带O2,自身不消耗O2,其内电解质以钾最多、钠含量较少,与血浆的钾钠含量相反。红细胞内Ca离子浓度低于血浆。,红细胞的特点,主要途径,磷酸戊糖旁路,葡萄糖酵解,合成ATP：合成2,3-DPG（2,3-二磷酸甘油酸）,控制静脉侧氧气的释放和维持Hb二价铁，进行氧气的传递,通过磷酸戊糖通路代谢，为红细胞提供另一种还原力，在红细胞氧化还原系统中发挥重要作用，具有保护膜蛋白、血红蛋白及酶蛋白的琉基不被氧化，还原高铁血红蛋白等多种功能。,红细胞能量代谢,成熟红细胞的糖酵解特点：,红细胞糖酵解的特点是在酵解过程中有相当数量的1.3-DPG转变成2.3-DPG，后者再脱磷酸变
3、成3-PG，并进一步酵解产生乳酸。此2.3-DPG侧支循环称2.3-DPG支路，产生支路的原因是红细胞中存在DPG变位酶和2.3-DPG磷酸酶，前者活性大于后者，故可使2.3-DPG堆积起来。2.3-DPG生成的主要生理意义在于降低Hb对氧的亲和力，在组织氧分压较低的情况下，HbO2放出氧适应组织需要。,血红蛋白与氧亲和性增加,P50是指血红蛋白氧饱和度为50%时的血氧分压，可以反映Hb与O2的亲和力。P50增大，氧离曲线右移，表示Hb与O2的亲和力小，P50减小，氧离曲线左移，说明亲和力大。,2,3-DPG的生理意义,维持Na+-K-ATP酶(钠泵)功能。通过ATP 提供能量,维持K+的浓度
4、在红细胞内比血浆高5倍。所以,红细胞产生的ATP主要用于维持红细胞膜Na+-K-ATP酶酶的正常功能,以保证红细胞的离子平衡。在保存过程中,红细胞膜和膜蛋白的损伤以及葡萄糖的持续消耗引起的ATP供能减少都会影响Na+-K-ATP酶功能的正常发挥,导致细胞内K+的逸出,从而使血浆K+浓度不断升高。,红细胞ATP的功能（红细胞内糖代谢的意义）,2、维持红细胞膜上钙泵一的正常运转，将红细胞内的Ca2+泵入血浆以维持红细胞内的低钙状态。正常情况下，红细胞内的Ca2+浓度很低（20umol/L)。，而血浆Ca2+的浓度为2-3mmol/L。血浆内钙离子会被动扩散进入红细胞。缺乏ATP时，钙泵不能正常运行
5、，钙将聚集并沉积于红细胞膜上，使膜失去柔韧性而趋于僵硬，使红细胞易被破坏,红细胞ATP的功能（红细胞内糖代谢的意义）,维持红细胞膜上脂质与血浆脂蛋白中的脂质进行交换。红细胞膜的脂质处于不断更新中，此过程需消耗ATP。缺乏ATP时，脂质更新受阻，红细胞可塑性降低，易于破坏少量用于谷胱甘肽的生物合成。用于葡萄糖的活化，启动糖酵解过程。,红细胞ATP的功能（红细胞内糖代谢的意义）,红细胞内的谷胱甘肽代谢,红细胞内谷胱甘肽含量很高(2mmol/L)，而且几乎全是还原型的，主要生理功能是对抗氧化剂对巯基的氧化。,对于需要短时间内纠正载氧能力的患者和特别经受不住组织缺氧的患者输入2,3-DPG水平低的血是
6、无益的，应该给这些患者输注保存期不超过710天的血液。,二、血液保存需要解决的问题,需解决的问题,血液凝固,红细胞溶血放氧能力下降,抗凝剂,红细胞营养代谢抗溶血剂改善放氧保存容器,红细胞保存液考虑的几个方面,保护细胞的能量产生机构，使其维持正常结构和功能尽量减慢细胞代谢速度，减少能量消耗并供应能量物质。其他：抗氧化剂的作用？改善保存容器？,常用血液保存液的成分：1、抗凝剂,血液抗凝剂是防止血液凝固和红细胞被破坏的化学物质,常用的抗凝剂有哪些？,血液保存液的成分,(一)血液抗凝剂,枸橼酸钠,肝素,EDTA2Na,原理,Ca,Thrombin,Ca,应用,实验室检测血液标本的抗凝及外科体外循环手术
7、的抗凝,实验室检测血液标本的抗凝,全血及血液成分保存的抗凝剂,葡萄糖的在血液中浓度应为0.5%l%，以0.5%为宜,葡萄糖用于维持红细胞代谢，延长红细胞的保存时间,血液保存液的成分：2、提供红细胞的能量代谢葡萄糖,腺嘌呤,提高ATP水平和活性的另一办法就是在保存液中加入少量腺嘌呤,腺嘌呤,磷酸腺苷（AMP）,磷酸化,ATP,血液保存液的成分：2、提供红细胞的能量代谢,血液保存液的成分：,3、抗溶血剂,目前国际上使用较多的是甘露醇，它的用量很小，一般在1以下。,血液保存液的成分：,4、改善红细胞的放氧能力,ACD或CPD血液保存到l周和2周后，其红细胞放氧能力均降到50%，对于即刻需要纠正缺氧的
8、患者，输注保存时间长的血液是不适宜的。,血液保存液的成分：,4、改善红细胞的放氧能力,影响因素：CO2分压、O2分压、pH和2,3-DPG含量及其生成有关酶系有关,一、全血在(42)时的保存,4、改善红细胞的放氧能力,解决的方法：1、保存液中加NaHCO3，所产生的C02，可由内在的Ca(OH)2来消除，避免pH降低，有利于2,3-DPG的合成2、加磷酸二羟丙酮，可以增加2,3-DPG含量。3、加丙酮酸盐、通过辅酶系统增加1,3-二磷酸甘油酸（1,3-DPG），然后变成2,3-DPG。4、加维生素C，增加还原力，进而维持有关酶的活性。,全血在(42)时的保存,保存温度,红细胞代谢缓慢，乳酸生成
9、速度下降，pH下降速度也变缓慢。,维持红细胞正常代谢，血袋要排放整齐，避免重叠堆积。,温度对红细胞保存的影响,6 以上时,无法保证血液成分的活性和有效性。高于10 红细胞破坏增加,10 以上超过30 min游离血红蛋白的含量逐渐增加,pH下降,血钾浓度也逐渐上升。保存温度低于下限2时,红细胞可能溶解破裂,输给患者可能造成输血不良反应。储存温度6 可最大限度地抑制血液中的细菌生长。在不正确的条件下储存30 min 以上的血液有发生细菌污染和(或)细胞功能丧失的可能,一、全血在(42)时的保存,保存容器,聚乙烯烃袋,聚氯乙烯（PVC)袋,全血、红细胞等的保存,血小板的保存,血液保存液,ACD保养液
10、（枸櫞酸盐-葡萄糖-枸橼酸）pH5.03 21天,CPD保养液（枸櫞酸盐-葡萄糖-枸橼酸-磷酸盐）pH5.63 21天,CPDA保养液(枸櫞酸盐-葡萄糖-枸橼酸-磷酸盐-腺嘌呤)pH5.63 35天,加入磷酸盐,加入腺嘌呤,二、血液保存液,三、血液在贮存中的变化,(二)贮存期（shelf life）,全血，聚氯乙烯塑料袋，4条件下贮存：ACD或CPD保存液：贮存期为21天CPDA-1保存液：贮存期为35天,一、浓缩红细胞保存,4保存保存液是全血保存液从采血日起，与相应的保存液的储存期一致,二、添加剂红细胞保存,浓缩红细胞,剩余营养物质少黏稠贮存中易发生溶血,二、添加剂红细胞保存,1、浓缩红细胞
11、加羟乙基淀粉（分子量3万）溶液在(42)贮存可保存14天。2、浓缩红细胞加磷酸腺嘌呤及庆大霉素的新维代浆血，在(42)可保存35天。,(一)含胶体的红细胞悬液（胶体代浆血）,二、添加剂红细胞保存,(二)晶体盐红细胞悬液（晶体盐代浆血）,目前还不能断定高水平的ATP是否为氯化氨的作用,有关理论也有待于进一步研究。但作者深信新溶液的保存作用,且有可能是氨的存在是基于这种溶液的非渗透性低渗的原因并得以维持ATP 的含量和延长红细胞的贮存期。,二、添加剂红细胞保存,(三)红细胞复苏液,复苏液（丙酮酸盐、肌苷、葡萄糖、磷酸盐、腺嘌呤及NaCl）,加入浓缩红细胞,37保温1小时,红细胞复苏：ATP和2,3
12、-DPG恢复到正常水平,输注前要去除复苏液,鉴定血液应在充分的自然光线或日光灯下进行（必要时可用放大镜检查）,一、正常血的肉眼观察,血液流入袋内多呈暗红色，有时呈鲜红色,血浆呈草黄色或淡黄色者为多见,分层,红细胞层呈暗红色,白膜层,分层界面清晰,一、正常血的肉眼观察,血浆层内不应有肉眼可见的血块、絮状物或漂浮物。有时出现不同程度的均匀乳黄色或乳白色脂肪颗粒样漂浮物，在37加温时易溶解呈透明状若细菌污染则加热后不透明。,一、正常血的肉眼观察,白膜层(buffy coat)，荷叶状、放射波浪状、雪花状、龟裂状等,一、正常血的肉眼观察,红细胞层暗红色不含肉眼可见的血凝块或其他异常物质。如果有气泡：1
13、周后逐渐消失 正常在保存中如气泡日渐增多，则有污染产气杆菌的可能。,一、正常血的肉眼观察,血液发出前，要仔细检查，观察是否有红细胞微小凝块，即冷凝集现象。冷凝集的血输用前加温，一般37 510分钟经保温的血液若有溶血发生则应放弃。,二、异常血的肉眼观察,一般库存血红细胞为暗红色，如果颜色变成暗紫色（高锰酸钾溶液颜色），则常常是细菌污染造成红细胞溶血的结果。这种血不能输用，必须进行细菌培养。,(一)血液颜色变化,二、异常血的肉眼观察,溶血：发生溶血的初期，血浆层底部首先变为红色或白细胞层出现玫瑰色的小环，这些现象是溶血初期的特征。溶血加重后，红色血浆部分则越来越多，并向上部扩展，最后全部血浆变为
14、红色。,(二)血浆层与红细胞层分界不清,二、异常血的肉眼观察,抗凝不佳：形成肉眼见到的小凝块，严重时可形成整个大块血凝块往往沉降在血细胞层内，可使整齐的表面变成凹凸不平。,(三)大量血块存在,二、异常血的肉眼观察,库存血亦可能发生大小不等的纤维蛋白絮状凝块，漂浮于血浆层表面或悬浮在血浆层中。多量、大块的血凝块或纤维蛋白块的存在，均表明血液质量不佳，不仅输血困难，也可能发生输血反应。原来血液没有凝块，保存后产生了血凝块，则应怀疑可能是细菌污染所致。,(三)大量血块存在,二、异常血的肉眼观察,乳糜：血浆内含过多脂肪。库存血如发生血浆明胶化现象，可能细菌污染，不能发出使用。,(四)血浆层呈乳糜或明胶
15、化,血液的冷冻保存研究开始于20世纪40年代1949年Polge和Smith等人发现甘油对牛精子的冷冻保存有保护作用，从中得到启示第二年，Smith应用甘油作保护剂冷冻红细胞获得成功其后，血液冷冻保存的研究迅速发展，但是由于没能解决去除防冻保护剂的问题，临床尚未能得到广泛应用。,1956年，Tullis应用Cohn分离器将防冻剂甘油去除，从而使冷冻红细胞成功地应用于临床。,1963年，Huggins发现红细胞在糖溶液中有可逆性的聚集反应，利用此反应原理，可用糖液洗涤法去除防冻保护剂甘油。,Meryman等人利用不同浓度梯度的氯化钠洗涤红细胞去除防冻剂,一、血细胞的低温损伤机制,低温损伤机制,w
16、hy？,一、血细胞的低温损伤机制,相变温度区间：细胞在冷冻或复溶过程中，发生液相和固相转变的温度区间在相变过程中，通常伴随吸热或者放热反应，以及体积的改变,一、血细胞的低温损伤机制,降温过程的低温损伤：来自于降温、复温过程中必须经过的一个温度区间，即15 至60 之间。该温度区间对细胞具有杀伤性。,一、血细胞的低温损伤机制,(一)盐变性学说,慢速冷冻细胞损伤的主要原因：Lovelock等人提出，细胞外水结冰时，细胞收缩、脱水使细胞内外产生的高浓度电解质，作用于细胞膜，引起脂蛋白复合物的变性和部分类脂质的丢失，增加了细胞对阳离子的通透性，并使细胞膜上形成一些小孔，冰融化时水进入细胞内引起渗透休克
17、,一、血细胞的低温损伤机制,(二)冰晶的机械作用,快速冷冻时细胞损伤的主要原因：在快速冷冻时，细胞内形成许多冰晶，冰晶作用于细胞膜，并使细胞膜上产生小孔，使得细胞膜不可逆地丧失其半透性,一、血细胞的低温损伤机制,(二)冰晶的机械作用,降温过快或过慢，都会杀死细胞在慢的降温速率下，细胞的低温损伤源于“盐变性”在高降温速率下，细胞的低温损伤源于“胞内冰”细胞冰冻保存的最佳降温速率，应该是慢到足以防止“胞内冰”，同时又快到使“盐变性”最小不同的细胞，由于细胞膜的生物特性不同，对最佳降温速率的要求也不同。,一、血细胞的低温损伤机制,(三)化学损伤,Levitt提出：冷冻时，在细胞脱水和溶质浓缩过程中，
18、蛋白质组分异常靠近，最终使蛋白质分子中巯基(SH)和二硫键(SS)发生相互不可逆的反应，形成新的化学键，导致蛋白质变性而引起细胞死亡。,一、血细胞的低温损伤机制,(四)细胞的融化反应,细胞复融过程中的损伤：融化反应尚不明确,一、血细胞的低温损伤机制,(四)细胞的融化反应,经验总结：慢速冷冻的标本应慢速融化快速冷冻的标本则应采用快速融化的方法,二、冷冻保护剂,冷冻保护剂可根据它们能否穿透细胞膜分为两种,细胞外保护剂,加入保护剂后，可降低溶液的冰点，并增加未冻水量,小分子,大分子,能自由地通过细胞膜,不能穿透细胞,二、冷冻保护剂,二、冷冻保护剂,(二)冷冻保护剂的种类,细胞内保护剂：甘油、DMSO
19、、葡萄糖、乙二醇、丙三醇、甲醇、乙醇、乙酸胺、甲酞胺等。细胞外保护剂：乳糖、麦芽糖、木糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、右旋糖酐、白蛋白、羟乙基淀粉（HES）、聚乙二醇（PEG）、甘露醇等。,三、低温血液保存与玻璃化,玻璃化就是生物材料在由液态向固态转化过程中没有相变热产生，也就是没有晶体生成。有人认为冷却速率达到10/秒，颗粒小于5l0nm就不会使生物材料受到冷冻损伤，这就叫玻璃化。,三、低温血液保存与玻璃化,添加冷冻保护剂或快速冷冻生物材料的目的就是使生物材料中的水处于容易达到玻璃化的状态。,四、红细胞甘油化、冷冻、融化和去甘油的方法,解冻：慢速融化去除甘油试剂可用糖液聚集法或不同浓度梯度氯化
20、钠洗涤法,解冻：快速融化去除甘油试剂可用不同浓度梯度氯化钠溶液，由高渗逐渐过渡到等渗分次洗涤,五、冷冻红细胞的制备方法,在我国普遍使用,高浓度甘油慢速冷冻,五、冷冻红细胞的制备方法,高浓度甘油慢速冷冻,盐液离心洗涤法,糖液聚集洗涤法,按解冻后洗脱甘油的方法：,方法：先采用高张溶液使融化的高渗红细胞渗透压达到平衡，接着用逐渐减低的高张溶液进行分次洗涤，最后用含有葡萄糖的等渗NaCl悬浮,五、冷冻红细胞的制备方法,等张溶液是指不引起红细胞膜变形的溶液，这个概念是从生理角度考虑的。有些溶质的等渗浓度与等张浓度相同或相近，如0.9%的氯化钠溶液，既是等渗溶液又是等张溶液。,五、冷冻红细胞的制备方法,有
21、些溶质如盐酸普鲁卡因、甘油、尿素等，等渗溶液不等于等张溶液。例如2.6%的甘油溶液与0.9%的氯化钠溶液具有相同的渗透压，但是2.6%的甘油100%溶血，所以是不等张的。高张溶液会使红细胞脱水皱缩，低张溶液会使红细胞吸水膨胀。,五、冷冻红细胞的制备方法,先采用高张溶液使融化的高渗红细胞渗透压达到平衡，接着用逐渐减低的高张溶液进行分次洗涤，最后用含有葡萄糖的等渗NaCl悬浮,内,外,高渗,水,高张,水,五、冷冻红细胞的制备方法,(一)慢速冷冻糖液聚集洗涤制备法,1、糖液聚集洗涤法去甘油原理,在pH5.26.1的范围内，血浆中的丙种球蛋白与红细胞膜的脂蛋白之间可形成一种可逆性的复合物,五、冷冻红细
22、胞的制备方法,(一)慢速冷冻糖液聚集洗涤制备法,1、糖液聚集洗涤法去甘油原理,当加入非电解质溶液时，如果糖、葡萄糖、蔗糖等，由于离子强度减小，与脂蛋白结合的球蛋白之间又可结合，使红细胞聚集成团块沉下来，除去甘油上清液,五、冷冻红细胞的制备方法,(一)慢速冷冻糖液聚集洗涤制备法,1、糖液聚集洗涤法去甘油原理,当加入电解质如生理盐水或升高pH值，可使球蛋白之间的结合断开，也可使丙种球蛋白与红细胞膜脂蛋白之间的结合断开，使红细胞重新悬浮,加等体积甘油化试剂,五、冷冻红细胞的制备方法,(一)慢速冷冻糖液聚集洗涤制备法,2、制备方法（国内改进）,ACD或CPD全血(200 ml),浓缩红细胞(90120
23、 ml),离心移出血浆,甘油化红细胞(室温平衡半小时),甘油化：分浆后所得的浓缩红细胞转移到专用洗涤塑料袋中，袋内装有一由塑料管密封的电磁搅拌器。在电磁搅拌器的搅拌下缓缓加入等体积的甘油试剂。,3740水浴中融化,冷冻红细胞,解冻红细胞,置-80冰箱或干冰中贮存,去甘油红细胞,加入等体积50%的葡萄糖溶液后，分别再用10%蔗糖溶液500 mL洗脱3次。分别去除上清,临床输用,测上清血红蛋白合格后,悬浮红细胞,加100 mL 0.9%NaCl洗涤，离心去上清，再加100 mL 0.9%NaCl重新悬浮红细胞,五、冷冻红细胞的制备方法,(一)慢速冷冻糖液聚集洗涤制备法,洗脱甘油：,国外均采用5%果
24、糖进行洗脱甘油，因果糖价格昂贵，我国用蔗糖代替果糖比较经济。,五、冷冻红细胞的制备方法,(二)慢速冷冻盐液洗涤制备法,使用不同浓度梯度的NaCl溶液先由高渗逐渐过度到等渗，可用大容量离心机反复离心或用连续离心机分离、洗脱掉冷冻红细胞的防冻剂，达到去甘油的目的。此方法比糖液洗涤法经济，红细胞回收率高，并且质量好,五、冷冻红细胞的制备方法,(二)慢速冷冻盐液洗涤制备法,1、制备方法,加入160 mL 57.1甘油化试剂,ACD或CPD全血(200 ml),浓缩红细胞(90120 ml),离心移出血浆,甘油化红细胞,3740水浴中解冻,冷冻红细胞,解冻红细胞,室温平衡半小时，置80冰箱或干冰中贮存,
25、去甘油红细胞,加入40 mL 9%NaCl，再加0.9NaCl 250ml，离心去上清，再加0.9%NaCl 400500 mL离心去上清，再用0.9%NaCl洗涤一次,临床输用,测上清血红蛋白合格后,悬浮红细胞,加100 mL 0.9%NaCl,五、冷冻红细胞的制备方法,(三)快速冷冻红细胞制备方法,1、制备方法,加入等体积甘油化试剂,ACD或CPD全血(200 ml),浓缩红细胞(90120 ml),离心移出血浆,甘油化红细胞,45水浴中3分钟内完全融化,冷冻红细胞,解冻红细胞,196冰冻，液氮蒸汽中贮存,一次洗涤红细胞,利用细胞分离器或标准离心机分次洗涤，加含有16甘露醇的生理盐水300
26、350 mL离心去上清,悬浮红细胞,加等体积的0.9NaCl或含有0.2葡萄糖的生理盐水悬浮,去甘油红细胞,加0.9NaCl或0.2葡萄糖的生理盐水10002000 mL离心去上清,五、冷冻红细胞的制备方法,(三)快速冷冻红细胞制备方法,2、甘油试剂配方,甘油(w/v)28%甘露醇(w/v)3%氯化钠(w/v)0.65,六、冷冻红细胞的质量标准,(一)红细胞回收率在80%以上(二)输入人体24小时后红细胞存活率在70%以上(三)洗涤后红细胞悬浮液上清血红蛋白不超过1 g/L(四)悬浮红细胞甘油含量在1 g/L以下(五)悬浮红细胞体外溶血试验上清液血红蛋白增加不超过50%(六)ATP、2,3-D
27、PG和红细胞脆性接近正常。(七)血液细菌培养应无细菌生长。,七、冷冻血的特点和临床应用,(一)优点,保存期可长达10年。能部分调节血液供求不平衡现象，特别为需稀有血型输 血的患者提供了方便，争取到了抢救时间。平时贮备，一旦需要可立即解冻洗涤，满足患者需要。对于自身输血者，可用此方法预先献血冷冻贮存，需要时解冻洗涤输用。,七、冷冻血的特点和临床应用,(一)优点,经过洗涤的红细胞，由于去除了绝大部分白细胞、血小板和血浆蛋白，减少了输血副反应。,七、冷冻血的特点和临床应用,(一)优点,冷冻血由于去除了细胞代谢产物、抗凝剂及可能的肝炎病毒，即使大量输注也可避免酸中毒、高钾血症以及减少肝炎的传播。由于去除了抗A抗B抗体，O型血真正成为万能供血者。,七、冷冻血的特点和临床应用,(一)优点,冷冻血的2,3-DPG含量与冷冻前区别不大，接近正常。输入人体后，氧的释放能力比常规方法保存血要好，可以立即纠正缺氧，这对于胸外科手术和新生儿换血有利。,七、冷冻血的特点和临床应用,(二)缺点,工艺较为繁琐，耗时较长，成本高。,
