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1、血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活力的测定,【目的要求】,1.了解血清ALT活力单位的定义。2.掌握血清ALT活性测定的方法及临床意义。,血清酶活力测定的临床意义,原理：正常情况下，血清中各种酶含量稳定，病理情况下则反之。如：许多组织器官的疾病表现为血清酶活力的异常。通过血清酶活力的测定可以作为器官，组织疾病及恶性肿瘤的临床诊断。造成血清酶活力异常的原因有：（1）细胞酶及细胞标志酶的释放入血液（2）酶的合成增强（3）酶清除受阻（4）器官功能损伤 详见p54,实例说明：ALT测定的临床意义,ALT广泛存在于机体的各种组织中，但在肝细胞中含量最多。当肝脏有病变时特别是急性肝炎及肝细胞坏死时，血清中A
2、LT活力显著升高。在肝癌，肝硬变及胆道疾病时，此酶活力也可中度或轻度增高。另外，其他脏器或组织疾病，该酶活力也升高。,how?,知识回顾:血清中碱性磷酸酶（ALP)活力的测定（磷酸苯二钠法）ALP磷酸苯二钠+H2O 苯酚+磷酸氢二钠 pH=10 酶促反应苯酚+4-氨基安替比林 铁氰化钾 红色醌亚胺衍生物 显色反应,碱性磷酸酶活力的测定的方法（标准对照法）,(2)本次实验的方法：改良赖氏法,卡门氏法酶活力单位：1ml血清（反应总量为3ml）在25，340nm，内径为1cm的比色皿，1分钟，A下降0.001的酶量,赖氏法：ALT丙氨酸+-酮戊二酸 谷氨酸+丙酮酸丙酮酸+2,4二硝基苯肼 OH-丙酮
3、酸-2,4-二硝基苯腙，,改良赖氏法,本实验卡门氏法测ALT活力的方法为什么被赖氏法取代？他们各自的测定原理，说明两种方法的区别与联系？,答：由于NADH在波长340nm处有特异吸收峰，因此ALT的活性可通过NADH（反应物）的减少量，亦即通过340nm吸光度的减少量间接作出定量测定。这一方法特异性、准确性高。但是此法除要加入待测酶ALT的底物外，还需要加入指示酶LDH及其辅酶NADH，又需用紫外分光光度计，因此不易为一般临床化验室推广。,答：丙氨酸+-酮戊二酸 ALT 谷氨酸+丙酮酸 丙酮酸+NADH 乳酸脱氢酶 乳酸+NAD+,卡氏测定ALT活力的原理,小结：区别与联系,实验原理：,知识链
4、接：,转氨基作用,是一种-氨基酸的-氨基转移到一种-酮酸上的过程。转氨基作用是氨基酸脱氨基作用的一种途径。其实可以看成是氨基酸的氨基与-酮酸的酮基进行了交换。作用：结果是生成了一种非必需氨基酸和一种新的-酮酸。,碱性条件下，产物由黄色变为红棕色,知识链接：,2,4二硝基苯肼的性质,红色结晶性粉末 分子量 198.14 微溶于水、乙醇，溶于酸 对眼和皮肤有刺激性。对皮肤有致敏性。本品吸收进入体内，可引起高铁血红蛋白血症，出现紫绀 遇明火极易燃烧爆炸。干燥时经震动、撞击会引起爆炸。燃烧时放出有毒的刺激性烟雾。与氧化剂混合能形成爆炸性混合物。【有害燃烧产物】一氧化碳、二氧化碳、氮氧化物,-酮戊二酸也
5、能与 2,4二硝基苯肼结合成相应的苯腙，在碱性条件下显色。对实验结果有何影响？,答：-酮戊二酸因其量不多，加之对520nm的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，-酮戊二酸对于结果影响不大，测定结果也比其他比色法（金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 法）和赖氏法（Reitman-Frankel法）准确。,实验试剂：,（1）ALT底物液【2 mmol/L-酮戊二酸,20 mmol/L丙氨酸】（2）pH=7.4的PBS（3）丙酮酸标准液2 mmol/L（4）2,4二硝基苯肼溶液【1 mmol/
6、L(5)0.4 mmol/L NaOH,（1）ALT活力的测定标准曲线的制作,混匀，室温10min,蒸馏水调零，520nm比色，绘制标准曲线(An-A0)卡门氏单位 0 28 57 97 150,测定前将底物液在37C水浴中预温5min,（2）酶活力测定,混匀，室温放置10min，以蒸馏水调零，在520nm比色，读取吸光度，以（AT-AC）查标准曲线，即得到血清中ALT的酶活力。参考值：525卡门氏单位注意事项，见书。,改良赖氏法较赖氏法的优点,改良赖氏法的反应温度(40改为37)和底物浓度(改为低浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率
7、法较为一致，能较好反映酶的真实活性。由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足，反应速度只能达到最大速度的65%；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后，新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。,思考题,（1）NaOH溶液作为终止剂，终止反应。同时也促进显色。,（2）前面已讲,标准对照法,AT-ACALT活力=AS-AB 57,（4）,ALT底物液 2,4-二硝基苯肼原因分析：ALT底物液的准确性影响到丙酮酸的生成量，继而影响到丙酮酸-2,4-二硝基苯腙的量，最终影响ALT活力的测定。2,4-二硝基苯肼为红色，过多会影响吸光度的值，过少丙酮酸反应不完，也会影响结果。,谢谢观看,
