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1、角蛋白结构功能与角蛋白遗传病,西安交通大学第二附属医院皮肤科肖生祥 冯义国 任小蓉 李建国刘艳李小莉 彭振辉谭升顺 冯捷 王俊民,2,角蛋白结构与功能 角蛋白遗传病基因突变和临床系列研究,3,角蛋白简介,角蛋白是上皮细胞的主要结构蛋白，构成细胞骨架中间丝（微丝、微管、中间丝）,4,角蛋白 目前已知49种,34种细胞角蛋白,15种毛 发角蛋白,型或酸性角蛋白（细胞角蛋白K9-10,K12-20,K23；毛细胞角蛋白Ha）Ha1-8,共25种型或碱性角蛋白（细胞角蛋白K1-K8；毛细胞角蛋白Hb）Hb1-6,共24种,研究背景,6,K1，K10 角化上皮的基底上层 BCIE/EH,DNEPPKK2
2、e 角化上皮基底上层的终末分化细胞IBSK2p 硬腭特异性角蛋白 未发现K3,K12角膜特异性角蛋白 MCDK4,K13非角化的复层鳞状上皮 如食道 WSNK5,K14表皮基底角质形成细胞，复层上皮 EBSK6a,K6c-f,K16掌跖，粘膜，伤口愈合时，表皮附属器 PC-1 K8,K18 单层上皮 如肝,肾 隐匿性肝硬化K9掌跖表皮 EPPKK15基底角质形成细胞 未发现K17,K6b表皮附属器，甲床，掌跖 PC-2K19单层上皮，表皮附属器 未发现K20胃肠道上皮 未发现hHb6,hHb1皮质毛细胞 念珠状发,角蛋白 主要表达组织 疾病,研究背景,角蛋白的结构,I型：II型：L1、L2、L
3、12 连接区（Linker domains)1A、1B、2A、2B 螺旋区（Helical domains)V1、V2 可变区（Variable domains)H1、H2 同源区（Homology regions）ISIS ISIS基元（ISIS motif)S 反向螺旋序列（Stutter sequence)HIP/HTP,2A,研究背景,角蛋白基因结构,I型：II型：,9,10,11,12,角蛋白不同结构区氨基酸数统计,13,角蛋白序列的保守性 1.不同个体之间的保守性:1A起始部和2B末端 15-20aa 2.不同角蛋白之间的保守性 螺旋起始区:I型 1A区第7个aa始 LNDRLAS
4、Y II型 LNNKFASY 螺旋终止区:EIATYRKLLEGE(如K1 2B末端倒数第5个氨基酸),14,角蛋白功能,参与上皮细胞角化、分化；机械性支持维持细胞形态；细胞内物质运输、信息传递,15,角蛋白基因敲除小鼠的表型,16,角蛋白与疾病,角蛋白 疾 病K1、K10 大疱性鱼鳞病样红皮病K5、K14 单纯型大疱性表皮松解症K6、K16、K17 先天性厚甲K8、K18 隐匿性肝硬化K9 表皮松解性掌跖角化症hHb6、hHb1 念珠状发K7、K15、K19、K20 不清楚,讨论,讨论,角蛋白中间丝的装配,19,角蛋白遗传病基因突变和临床系列研究,20,技术路线和实验方案,患者家系基因突变分
5、析 收集患者家系临床资料、病理标本、采集外周血 提取外周血基因组DNA PCR扩增外显子 DNA序列分析 患者正常人同源性分析 确定基因突变位点 排除多态性,21,先天性厚甲症（Pachyonychia congenita，PC）是一组常染色体显性遗传病，特点是甲营养不良和不同程度的外胚叶发育不良。,22,根据临床表现主要分为两型,PC-1表现为厚甲伴有局灶性掌跖角化、口腔粘膜白斑等。PC-2除具有PC-1的特征外还伴有胎生牙和多发性脂囊瘤。多发性脂囊瘤是PC-2最好的鉴别特征。,23,PC患者的厚甲通常是在出生后头几个月出现。一些PC患者甲改变发生较晚，称为迟发性先天性厚甲。多发性脂囊瘤通常
6、在青春期发生。研究发现，PC-1由于角蛋白K16、K6a基因突变所致，PC-2由于角蛋白K17、K6b基因突变所致。,24,先证者及其子的厚甲,25,先证者头部多发性脂囊瘤,26,先证者及其子的多发性脂囊瘤,27,先证者及其子的局灶性掌跖角化,28,29,30,研 究 方 法,31,1.血样采集 采集家系成员（包括9例患者、1例正常人）外周血35ml，2EDTA抗凝，-70冷冻保存。另外抽取正常对照50人份外周血做同样处理。,32,2.外周血基因组DNA提取 用全血基因组DNA纯化试剂盒提取基因组DNA。,33,3.聚合酶链反应（PCR）,选择并合成引物：引物合成参照Mclean WH等在Na
7、ture Genetics 上的文献。上游引物K17p8和下游引物K17p10。这对引物可使角蛋白K17基因外显子1及其侧翼序列得到选择性扩增，扩增出978bp的DNA片段，并且避免了扩增两个假基因K17B和K17C。,34,K17P8和K17P10扩增的DNA片段稀释1:10000倍作为巢式PCR模板。巢式PCR的上游引物序列为：5-GCTGCTACAGCTTTGGCTCT-3；下游引物序列为5-CACGACGTTGTAAA ACGACCAGTCACGGATCTTCACC-3。,35,PCR反应：总体积为50l,反应液成分包括5l缓冲液，10mmol/L dNTP 1l，25mol/L上、下
8、游引物各1l，Taq酶0.5l（2.5U），25 mmol/L MgCl2 5l,模板10l。反应条件：,36,4.基因测序 PCR产物采用全自动DNA测序仪进行序列测定，测序结果进行同源性分析。,37,结 果,38,1.DNA提取结果 外周血全基因组DNA提取后电泳，可见其大小约为23kb（Marker为DNA Hind)。,39,2.PCR反应结果PCR反应产物电泳，扩增出大小为978 bp的DNA片段（Marker 为DGL2000)。,40,patient,normal,41,3 DNA测序结果,患者,患者,正常人,正常人,42,讨 论,43,体外实验表明，1A区起始部的突变对角蛋白装
9、配影响较大，而1A区后半部的突变对角蛋白装配影响较小。临床上发现的角蛋白突变位于1A区后半部的较少。,44,角蛋白17模式图及我们发现的突变位置,45,我们发现的突变为角蛋白K17的N109D突变,为一新的错义突变。因此，在进行中国人PC-型基因诊断或产前诊断时，除了参考国际上已报道的突变位点外，应注意这一新的突变位点的可能性。,46,我们报道的这一PC-家系，厚甲均为迟发（10至20岁发生），基因突变位于K17 1A区的后半部，为一新的突变N109D。,47,结合Connors等和我们的研究结果，K16 2B区中间部和K17 1A 区后半部的基因突变可以呈现为迟发型厚甲。我们的研究结果表明角
10、蛋白的突变位置与疾病的发生年龄有关。发生在角蛋白非关键部位的突变引起疾病迟发。,48,通过2个家系初步的研究表明，中国PC-2型患者基因突变与其他种族相比，有相同之处，又有不同之处。本研究为进行中国人PC-2型基因诊断及产前诊断奠定了基础。,49,单纯型大疱性表皮松解症的基因突变及临床研究 Investigation on Gene Mutations and Clinical Phenotypes of Epidermolysis Bullosa Simplex,结果,1.临床资料,家系一 先证者，女，30岁。自述自幼年起至今，四肢末端，特别是手足部位受摩擦后出现黄豆至核桃大小水疱、大疱；在
11、春夏季节发作较频繁。家庭情况：先证者的女儿及母亲生前有相同症状；父亲、哥哥正常，未曾出现过类似皮损。,结果,双足摩擦部位可见水疱、大疱,结果,双足跖可见大疱及灶状角化过度,结果,家系谱图,结果,散发病例一,患者，男，11岁。在出生后3天，双足出现蚕豆至鸽卵大小的大疱，自行愈合，未留瘢痕；约在生后3、4月时，手足、四肢陆续出现水疱、大疱，躯干部位亦出现水疱，但主要集中在四肢远端部位。就诊时在四肢远端可见散在的水疱、大疱以及水疱干涸后的结痂；家庭情况：父母正常，妹妹正常。,结果,双手掌、腕部可见水疱、大疱,结果,2.HE染色结果,水疱及裂隙看似位于表皮下,结果,3.PAS染色观察,阳性反应的基底膜
12、位于裂隙的底部，提示水疱位于表皮内。,结果,皮损附近基底层细胞可见有空泡，提示水疱裂隙位于表皮内。,结果,4.透射电镜观察,D.真皮，E.表皮，BM.基底膜，水疱裂隙。,结果,双足跖可见灶状角化过度,结果,散发病例二,患者，男，39岁，自述自幼年至约18岁期间，手足、小腿等部位频繁出现水疱，自行愈合后不留瘢痕；在春夏季节发病较频繁；成年后，发作次数明显减少。双足跖、趾腹承重部位灶性至弥漫性角化过度。指（趾）甲轻度至中度营养不良。家庭情况：其一子一女正常，父母生前无类似症状。,结果,双足跖、趾腹部可见灶状至弥漫性角化过度。,结果,指（趾）甲营养不良,结果,散发病例一和散发病例二系谱关系见下图,结
13、果,K5基因外显子4-5直接测序图,患者DNA序列显示第328密码子的第二个碱基（）发生AG杂合性突变（双峰），氨基酸由甘氨酸替代天冬氨酸（GAC）。,健康者对照序列,结果,K14基因外显子1直接测序图,对照健康人DNA序列,散发病例一的K14基因第661位出现双峰，引起第115个密码子由谷氨酸（GAG）变为赖氨酸（AAG）,散发病例二发生同样突变,结果,K14基因外显子1单核苷酸多态性（一）,50位健康人DNA pool直接测序结果显示第449位碱基为G（图中标记），密码子（第44个）为丝氨酸（AGC）；GenBank序列相应碱基为A，密码子为天冬酰胺（AAC）。,TGCCGCGCCCCCA
14、ACACCTACG,结果,K14基因外显子1单核苷酸多态性（二）,50位健康人DNA pool直接测序结果显示第687位碱基为C（图中标记），密码子（第123个）编码天冬酰胺（AAC）；GenBank序列相应碱基为T，同样为天冬酰胺（AAT）,CCTCAATGACCGCCTGGCCT,结果,K5基因内含子6核苷酸多态性,50位健康人DNA pool直接测序结果显示第37663768位碱基为AAA（图中标记）；GenBank序列相应碱基为CCC。,GACCCAGCCCCTCAGAAGGAGA,70,EBS-DM家系基因突变研究,71,前言,大疱性表皮松解症（Epidermolysis Bullo
15、sa,EB）是由于皮肤真表皮交界处结构异常而引起的一组遗传异质性疾病，单纯型大疱性表皮松解症（Epidermolysis Bullosa Simplex,EBS）是其中的一类。EBS病因：角蛋白5或14的突变。,前言,EBS研究现状,目前已有许多与EBS相关的突变报道，已总结出一些突变规律。但是新的基因突变的报道仍层出不穷。根据EBS发病率估计，我国大约有32000位EBS患者。而在此方面的研究报道很少。,研究背景,单纯型大疱性表皮松解症的主要特征,EBS-DM：1.水疱自新生儿期出现，泛发全身，多呈疱疹样排列；2.口腔粘膜常受累及；3.常常伴有进行性掌跖角化过度，甲营养不良；4.在超微结构下
16、，裂隙位于表皮内，基底层细胞浆内有聚集成团块的角蛋白中间丝；5.病情不随季节变化而变化。6.绝大多数由HIP/HTP序列发生突变造成。,研究背景,EBS-WC,1.患者通常学习走路时开始出现水疱，主要发生在手足部位，部分患者仅在足部出现水疱；2.口腔粘膜通常不受累及；3.有时伴有灶状的掌跖角化过度；4.在超微结构下，裂隙位于表皮内；5.病情在温暖季节加重，凉爽季节减轻；6.由螺旋区和连接区突变引起。,研究背景,EBS-K,1.多数患者在出生时或生后不久出现水疱，少数在一岁内出现症状；皮损泛发全身，但主要分布在手、足、肘、膝等部位；2.口腔粘膜也可以见到水疱；3.伴有掌跖角化过度,少数患者甲增厚
17、，个别患者甲可脱落；4.在超微结构下，裂隙位于表皮内；5.病情在温暖季节加重；6.多数由螺旋区突变引起。,讨论,基因突变与表型的关系,发生在角蛋白杆状区的HIP和HTP片段：EBS-DM杆状区的非高度保守序列：EBS-K、EBS-WC有例外情况：如在K14基因HIP片段，M119TEBS-DM，M119VEBS-K，M119IEBS-WC。,讨论,D328G突变,位置：K5的L12连接区的第12氨基酸；L12区（K5和K14）：已发现16例突变多数：EBS-WC，3例EBS-K。第328位：天冬氨酸（GAC）谷氨酸（GAA）、组氨酸（CAC）和缬氨酸（GTC）,讨论,E115K突变,位置：H1
18、片段末端并与HIP相连H1片段的作用：尚不清楚，Wilson等的实验表明头部缺失115个氨基酸（即包括全部H1区）的K14与K5只能形成极少量的中间丝，而且长度显著缩短 突变情况：未见报道；,80,结 论,在家系一患者K5基因中发现尚未报道过的新错义突变D328G；在两例有血缘联系的散发病例中发现K14新的同样的错义突变E115K；首次发现中国人群K14基因第449位碱基存在单核苷酸多态性：AG突变；在中国人群K5基因第6内含子第3766至3768位碱基（AAA）检测到与报道不相同的序列(CCC)；,81,论文题目：A new mutation in L12 domain of keratin
19、 5 in a Chinese family with Weber-Cockayne Epidermolysis Bullous Simplex发表刊物：Clinical and Experimental Dermatology.2004,29(5):539-41,82,先天性大疱性鱼鳞病样红皮病1家系的基因突变研究,83,又称表皮松解性角化过度,其临床表现主要是出生时即有红斑和水疱,随着年龄增大，水疱可以得到改善，代之以表皮增厚和脱屑。成人以四肢屈侧及皱褶部位棕褐色增厚或疣状角化过度伴有少量的糜烂和松弛性水疱为特征。90%的患者在1 岁时开始有皮肤损害,71%出生时就有。约有半数病人有阳性家
20、族史。,84,85,先证者，男，42岁，自出生全身泛发过水疱，自幼掌跖角化过度，现颈部、肘部伸屈侧、臀部、膝关节伸屈侧角化过度，冬重夏轻，无瘙痒。,86,其次子15岁，自半岁起有广泛的水疱、掌跖角化过度。现躯干皮肤弥漫性棕黄色的较厚角化过度性鳞屑，鳞屑脱落区露出粗糙的潮湿面,躯干、肘关节屈、伸侧和膝盖角质样的皮肤增厚上有干燥脱屑，有时出现水疱、大疱,冬重夏轻,无瘙痒。掌跖高度角化过度(图1)。其长女、长子无异常（图2）。,87,88,组织病理 表皮角化过度、颗粒细胞增厚变性,细胞核周围见腔隙,乳头瘤样增生,真皮浅层个别血管周围少量淋巴细胞,组织细胞浸润(图3),89,90,91,92,93,对
21、全部PCR产物测序后发现，该家系两患者K1基因2号外显子第623位碱基出现TC的杂合突变，家系中的正常人及50例无关正常人均无此种改变。此替代引起编码角蛋白1 1A区第208位氨基酸的密码子发生改变，使其编码的氨基酸由亮氨酸变为脯氨酸（L208P）。,94,95,角蛋白K1基因突变所致的BCIE的特征性临床表现包括显著的掌跖角化；角蛋白K10基因突变所致的BCIE有显著的躯干受累，而无掌跖角化。,96,先天性大疱性鱼鳞病样红皮病1家系的基因突变研究结果被Journal of Dermatological Science接受发表,97,先天性念珠状发合并外耳道闭锁的基因突变及临床研究,98,99
22、,100,101,男()女()患者 男()女()健康者 先证者表示世代数+被采血者,+,+,102,详细询问病史，全面体格检查，明确临床诊断。取患者病发制片在显微镜下观察。外周血基因组DNA提取聚合酶链反应（PCR）:hHb6第7外显子 DNA测序,103,结 果,104,病发在显微镜下呈典型的念珠状，结节和狭窄交替出现。病发发外和发内未见菌丝和孢子。,105,106,PCR产物,200016001000750500250,1泳道，DGL 2000 DNA Marker;2、3、4、5泳道，预期361bp PCR 产物。,107,图5（a）先证者第一次测序结果：示E402K突变，GAGAAG,
23、图5（b）先证者第二次测序结果：示E402K突变，GAGAAG,108,图5（c）先证者之父第一次测序结果：示E402K突变，GAGAAG,图5（d）先证者之父第二次测序结果：示E402K突变，GAGAAG,109,图5（e）50人份正常人DNA测序结果：示E402密码子，GAG,人hHb6基因的GeneBank序列：cagagagacccaagggactctaatctaccttgttctctctgttc红色a 示第4374位碱基缺失位置。,110,图6（a）示50人份正常人第4374位单核苷酸（碱基A）缺失多态性,图6（b）示先证者第4374位单核苷酸（碱基A）缺失多态性,111,图6（c）
24、示先证者之父第4374位单核苷酸（碱基A）缺失多态性,112,hHb6基因的2B区117位残基发生的E413K突变是最常见的突变，hHb6的E402K为第二位的常见突变。,113,论文名称：A Novel Mutation in the Second Half of 1A Domain of Keratin 17 in a Large Pedigree with Delayed-onset Pachyonychia Congenita Type 2.发表刊物：Journal of Investigative Dermatology，2004，122（4）：892-5 被引用情况:6次,114,
25、论文名称：Keratin 17 mutation in pachyonychia congenita type 2 with early-onset sebaceous cysts.发表刊物：British Journal of Dermatology,2003,148(3)：452-5被引用情况:4次,115,论文名称：迟发型先天性厚甲症角蛋白17基因 新的突变检测发表刊物：中华医学杂志，2003,83(20):53-55,116,论文名称：先天性厚甲症II型一家系角蛋白17 基因突变的研究发表刊物：中华皮肤科杂志,2003,36(2):64-6,117,基因突变分析的意义,基因诊断、产前诊断 基因型与表型的关系 基因治疗的基础,118,上皮组织脆性遗传病存在许多角蛋白基因突变。由基因突变研究获取的基因型-表型相关性的知识为角蛋白功能提供了丰富的信息，这些信息如采用单纯的转基因研究可能需花费几十年时间才能取得。基因工程突变小鼠研究进一步补充了人体疾病研究，在小鼠可构建在自然或疾病状态见不到的遗传改变。Porter RM,Lane EB.Trends in Genetics,19(5)278,2003.,
