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1、分子生物学技术,目前缺乏标准化的方法WHite运用实时定量PCR方法对203例血液病患者全血标本进行曲霉检测，结果发现在确诊/高度拟诊的患者中，阳性率为92.3%;与G实验和GM实验及高分辨CT有良好的一致性,分子生物学技术,台湾学者运用液相芯片技术，基于所有真菌的高度保守序列如18S、28S和高度可变的内部转录间隔区(ITS)，前者用于筛选真菌感染，后者用于菌种的确定，同时对64种真菌进行鉴定，敏感性和特异性均大于97%，1天内完成J Clin Mic 2005,43:3760-3768,分子生物学技术,存在问题1.外来的污染2.不能有效地区分定植和感染3.不能指导临床何时开始及停止抗真菌治
2、疗,真菌的病理检查,真菌的病理检查,PAS阳性的念珠菌菌丝,真菌的病理检查,HE染色真菌菌丝,真菌的病理检查,肺隐球菌PAS阳性,组织病理学检查,侵袭性曲霉感染：侵犯血管，引起病变部位的栓塞、出血及坏死非特异性炎症、化脓性改变或肉芽肿形成,组织病理学检查,组织内曲霉：镜下菌丝常呈45分枝、有隔、透明且粗细均匀,直径约36m,有菌丝反复分枝现象，排列成放松射状或珊瑚状。有些慢性损害中菌丝常呈不规则扭曲状特征性的菌丝：诊断曲霉感染最可靠的依据,组织病理学检查,HE染色呈蓝色略带红色，PAS染色呈红色 嗜银染色呈黑色菌丝横切面与孢子的鉴别：孢子往往成群分布，直径小于菌丝,曲菌菌丝,甲胺银染色:曲霉球
3、(烟曲霉),毛霉菌的实验室诊断,与外界相通部位分离出毛霉菌不一定有意义无菌部位标本阳性培养有意义支气管肺泡灌洗液直接镜检常用分子生物学技术,真菌药敏判断标准解读,抗真菌药物敏感试验,过去试验方法及存在问题液基稀释法(broth dilution)微量液基稀释法(broth microdilution)琼脂混合法（agar incorporation）（即过去广泛使用的药基法）琼脂扩散法(agar diffusion)问题：影响因素过多，结果重复性差,美国国家临床试验室标准委员会（NCCLS）方案,1982年起美国国家临床试验室标准化委员会（NCCLS）组织专家进行了一系列试验。1992年：NC
4、CLSM27P文件对念珠菌和隐球菌液基 稀释法提出药敏测试标准化方法，属建议性质。1995年：NCCLSM27T文件，属试验性质。1997年：NCCLSM27A文件，属确认性质，加入了微量稀释法1998年：NCCLSM38P文件丝状菌微量液基稀释法提案,NCCLS M27-A方案,酵母菌的液基稀释法抗真菌药敏试验参考方案（Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts）已批准的标准方法，包括微量稀释法（microdilution)主要适用于：念珠菌和新生隐球菌2002年出版了M27-
5、A2方案,NCCLS M38-P 方案,产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药敏试验参考方案（Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Conidia-Forming Filamentous Fungi）提出的标准方法，微量稀释法 主要适用于：如曲霉、镰刀菌、米根霉、波氏假阿利什霉、申克孢子丝菌（菌丝相）等。我们已根据此法，进行了皮肤癣菌的药敏试验2003年推出M38-A方案,M44-A方案,2004年CLSI出版了使用美蓝MH琼脂平板，纸片为Rosco公司生产的各种抗真菌药物纸片,M27-A2药
6、敏判读,对于酵母菌（念珠菌、新型隐球菌，不适用于其他真菌）：氟康唑:35度、40-50h(隐球菌70-74h)，与生长对照菌比较80%受抑制为判定点如MIC8g/ml报告敏感，64g/ml报告耐药，16-32g/ml则是剂量依赖敏感光滑、克柔不适用,M27-A2药敏判读,伊曲康唑的MIC定义同氟康唑如MIC 0.125g/ml,提示受试黏膜感染的念珠菌敏感，如1g/ml报告耐药0.250.5g/ml提示为剂量依赖敏感目前无黏膜外的侵袭性念珠菌感染的折点判定标准,M27-A2药敏方案的临床意义1）,耐药菌株的鉴定与监测：念珠菌对FCZ的耐药问题日益严重 AIDS患者经FCZ治疗后出现较多白念珠菌
7、的耐药株 MIC值升高，随FCZ剂量增大 分子生物学方法可证实同一菌株产生耐药,M27-A2药敏方案的临床意义(2）,拓展新的药敏试验方法：微量稀释法、E-test法等均以M27-A为基础，从不同角度为临床提供更简捷，易推广的药敏试验技术,M27-A2药敏方案的临床意义(3),应用于抗真菌新药的研究 评估新的抗真菌药物的抗真菌效果 扩展到丝状真菌药敏试验 以此为基础，对曲霉、镰刀霉、根霉、波氏霉样真菌、孢子丝菌已形成M38-A方案（2003年），但皮肤癣菌还有待纳入,体外抗真菌药敏试验与体内疗效的一致性,NCCLS M27-A 90-60原则MIC值与临床疗效药敏试验敏感菌株：90%对治疗有效
8、药敏试验耐药菌株：60%对治疗有效,NCCLS对药敏结果的解释,MIC不是一个物理或化学的指标 在实际临床治疗中，宿主因素往往比药敏试验结果更为重要 体外药敏结果敏感并不预示治疗成功 体外的耐药常预示治疗失败,产孢丝状真菌抗真菌药敏试验NCCLS方案 M38A简介,M38-A，微量肉汤稀释法适用于曲霉属、镰刀霉属、结合菌、赛多孢属、孢子丝菌等丝状真菌。该方案仅对试验条件和判读标准进行了统一，并没有给出M IC的判定折点,药敏判读,在终点判读时，将伊曲康唑由原方案的生长抑制改为生长抑制，即读数为时的最低药物浓度 新型三唑类药物的MIC值定义也是如此 原因是伊曲康唑和其他新型三唑类药物，与氟康唑和
9、酮康唑不同，判读终点时不存在拖尾 质控菌株增加了：-黄曲霉ATCC204304-烟曲霉ATCC204305,药敏判读,丝状真菌对两性霉素B 的M IC 值一般在0.15-2 mg/L,但是部分真菌(如:土曲霉、枝顶孢霉、尖端赛多孢霉、足分支霉)MIC 可能超2mg/L。一般认为,MIC 2 mg/L,两性霉素B治疗有可能失败。丝状真菌通常对5-FC和氟康唑不敏感,MIC往往大于64 mg/L。丝状真菌常侵袭组织,MIC和药物组织浓度的关系对于临床治疗指导意义更大,药敏判读,因此,目前对于丝状真菌的体外诊断,更有意义的不是药敏试验,而是仔细地将致病真菌鉴定到种 举例说明:如果分离到土曲霉、尖端赛
10、多孢霉、足分支霉,就知道这些真菌通常对两性霉素B耐药,纸片扩散法,将含有一定量抗真菌药物的纸片置于接种有一定量真菌的平皿中，在一定的温度经过一定时间孵育后，通过测量抑菌圈的大小来判断受试真菌对于该药物的敏感性 该方法简单直观，已有商品化 缺点：不能精确量化,酵母菌纸片扩散法敏感试验(CLSI)M44-P,M44-P 酵母菌纸片扩散法敏感试验方案，制定了氟康唑(fluconazole)和沃尔康唑(voriconazole)质控株的参考范围及氟康唑的抑菌环解释标准研究证实氟康唑对酵母菌药敏试验有较好的重复性，可准确地检测酵母菌对氟康唑的敏感性,ROSCO 酵母菌纸片扩散法,改良Shadomy琼脂或
11、RPMI 1640琼脂加热溶解后倒入9cm平皿（20ml）新鲜具活力的纯化的酵母菌落以生理盐水制成5*105FU/ml(配制成0.5麦氏浊度后再以生理盐水对倍稀释)接种：平皿先置35干燥2025分钟，倾注0.5ml菌液于平皿表面，均匀涂布，用移液管吸除多余的菌液35干燥15分钟后贴上药物纸片 培养：35 1824小时，如未见明显生长，再放24小时。隐球菌：30 4248小时,结果判读,氟康唑、酮康唑、氟胞嘧啶：20mm 敏感 12-19mm 中介11 耐药两性霉素B、伊曲康唑、制霉菌素:15mm 敏感 10-14mm 中介无抑菌圈 耐药,E-test法,是一种商品化的抗真菌药物敏感性方法 采用
12、被不同量的抗真菌药物包被的特殊试剂条，受试药物包括氟康唑、伊曲康唑和两性霉素B等 该方法操作简单、直观，与NCCLS法有较好的一致性 缺点：结果判定需有一定经验，价格昂贵,E-test法,基本原理：用特殊技术将抗菌药物在一试剂条上形成一个定量连续梯度,其培养基、菌接种浓度、培养温度及时间等条件基本按照M-27方案所推荐的条件E-test法已被用于某些霉菌如曲霉属、镰刀菌属和根霉属的药敏检测,E-test法,E-test抗真菌药敏试条：二性霉素B(AP)5氟胞嘧啶(5-FC)酮康唑(KE)伊曲康唑(IT)氟康唑(FL)起始浓度:32mg/L终末浓 度:0.002mg/L,丝状真菌的E-test药
13、敏试验,流式细胞检测法,原理:检测不同药物浓度作用下各药物浓度管的荧光强度，根据荧光强度的梯度变化趋势，判定药物抗菌活性的一种方法对流动液体中排列成单列的细胞和颗粒进行检测，分析其光散射和荧光，从体积、内部结构等物理及化学特征判断真菌活力和功能状态。,深部真菌感染存在的问题总结,真菌广泛定殖于人体的各个部位及存在于周围环境中，在免疫缺陷者引起感染。临床医师诊断困难：没有典型症状和体征缺乏良好的检查方法，或检查的价格昂贵临床医师送检的标本不注重真菌的监测送检的标本不合乎真菌检验的要求实验室的检测阳性率不高，如血培养（30-50%）实验室的结果在临床上难以解释：污染？定植？致病？,曲霉菌的生长速度非常快，更迫切需要早期、及时的诊断治疗,1-2 mm/小时,原来照片位置,
