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1、质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb到200kb。大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。,一、实验原理,实验二 质粒DNA的分离、纯化,可再生资源利用与加工实验教学中心,质粒DNA煮沸法,煮沸法原理,染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒D
2、NA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,质粒DNA碱裂解法,碱裂解法原理,当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一
3、起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。,碱裂解法流程图,对数期菌体,溶液III中和,溶液I充分重悬,溶液II裂解,上清液,抽提,离心洗涤,酒精沉淀,干燥溶解,沉淀,质粒DNA溶液,菌种：E.coli MV1184（含pUC118）、E.coli K12（含pEGFP）设备：eppendorf管、微量取液器(20l,200l,1000l)，台式高速离心机，涡旋振荡器试剂：LB液体培养基、溶液、溶液、溶液、RNA酶A、饱和酚:氯仿 1:1,二、材料、设备及试剂,溶液：50mM 葡萄糖；25mM TrisHCl（pH8.0）；10mM EDTA溶液：（新鲜配制）0.2N
4、 NaOH；1%SDS溶液：5M KAC 10ml；冰醋酸 11.5ml；水 28.5ml,1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4下12000g离心30秒。2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。3、菌体沉淀重悬浮于100l溶液中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。4、加入新配制的溶液200l,盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。5、加入150l预冷的溶液,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4下12000g离心5-10分钟。6、上清液移入干净eppendorf管中
5、,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4下12000g离心5分钟。7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20冰箱中20分钟，然后4下12000g离心10分钟。8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70乙醇洗沉淀一次,4下12000g离心5-10分钟。9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。10、将沉淀溶于20l TE缓冲液(pH8.0，含20g/ml RNaseA)中，储于-20冰箱中。,三、操作步骤,实验结果：获得质粒DNA（pUC118及pEGFP）,四、注意事项材料准备,使用处于
6、对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）,四、注意事项细胞裂解,菌体量适当。培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断。复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染。G菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁。,四、注意事项核酸分离、纯化,采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的
7、特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,四、注意事项核酸沉淀、溶解,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解,菌体老化碱裂解不充分菌体中无质粒溶液使用不当,请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养可减少菌体用量或增加溶液的用量不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。溶液在温
8、度较低时可能出现浑浊，置于37保温片刻直至溶解为清亮的溶液。,五、质粒DNA提取常见问题,问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？,原因,对策,混有蛋白混有RNA混有基因组DNA,不要使用过多菌体。重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质加入RNaseA室温放置一段时间加入溶液II 和III后防止剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。,五、质粒DNA提取常见问题,问题二：质粒纯度不高，如何解决？,原因,对策,1.简要叙述溶液、溶液和溶液的作用，以及实验中 分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因。2.染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？,六、问题与讨论,
