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1、实验三十,质粒DNA的小量快速提取（碱裂解法）,CONTENTS,1.实验背景,质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb到200kb。大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。,1.实验背景,质粒的类型1.严谨型：只在细胞周期的一定阶段进行复制，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有12个质粒。2.松弛型：质粒在整个周期中随时可以复制，当染色体复制停止后，质粒依然能复制，每个细胞中含有10200个拷贝。,1.实验背景,质粒的应用 大多数基因工程使用松弛型质粒
2、。严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。,2.实验目的,掌握碱裂解法提取质粒的原理、步骤及各个主要试剂的作用。,3.实验原理,细菌,SDS碱性环境,变性染色体DNA,变性质粒DNA,蛋白质SDS复合物,不能复性且形成缠连的网状结构,复性并溶解在溶液中,蛋白质SDS复合物,取上清液后乙醇沉淀质粒DNA,和大分子RNA沉淀下来，用酚/氯仿除去残留蛋白质,离心,酸性醋酸钾,4.实验试剂,1.溶液：50mm/L葡萄糖 25mm/L TrisHCl（pH8.0）10mm/L
3、EDTA溶液1的作用：分散细胞，蟄合金属离子使金属酶失活。2.溶液：（新鲜配制）0.2mol/L NaOH,1%SDS 溶液2的作用：使细胞壁在碱性条件下破裂，核酸和蛋白质变性。3.溶液：5mmol/L KAC 10ml,冰醋酸 11.5ml,水 28.5ml 溶液3的作用：使PH值恢复至中性，质粒DNA复性，染色体DNA与蛋白质-SDS复合物沉淀。4.酚氯仿：作用:使蛋白质变性，进一步除去少量残留的蛋白质5.无水乙醇：作用:除去DNA水化层，使DNA沉淀6.70%乙醇：作用：洗去质粒DNA沉淀中含的少量盐7.RNaseA:核糖核酸酶A 作用：降解DNA污染物（RNA）8.TE缓冲液，LB液体
4、培养基,4.实验仪器,高压灭菌器恒温摇床高速离心机微量可调式移液器1.5m离心管,5.实验操作,1.细菌培养,2.收集菌体,3.悬浮细菌,4.碱性裂解,5.中和与复性,6.离心沉淀,7.酚/氯仿抽提除蛋白,8.乙醇沉淀质粒DNA,9.乙醇洗盐,10.溶解质粒DNA,注意：加入溶液1后，一定要彻底悬浮细菌沉淀，否则所提质粒DNA的纯度及得率会大大降低。,注意：此步需轻柔混合，不要剧烈震荡，以免打乱基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组片段。此时菌液应变得清凉粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。,注意：溶液3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。,细菌培养,细菌的收集和裂解,质粒DNA的分离和纯化,详细步骤：P206,5.实验步骤,DNA的保存1.短期贮存：4或-20存放与TE缓冲液中。TE缓冲液的PH与DNA储存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。2.长期贮存：置于TE缓冲液中-70可保存数年，在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染,
