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1、转基因与敲除技术,转基因技术,1,定义,转基因技术：将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的变化，这一技术称之为转基因技术（Transgene technology）。,转基因技术基本原理,1、目的基因的获取,2、克隆载体的选择和构建,3、外源基因与载体的连接,4、DNA导入受体,5、重组体的筛选,6、克隆基因的表达,重组DNA技术操作的主要步骤,目 录,(插入失活法)抗药性标记选择,目 录,原位杂交,目 录,Southern印迹,目 录,常用的植物转基因方法,遗传转化的方法按其是否需要通过组织培养、再生植株可分成两大类:1、需要通过组织培养
2、再生植株，常用的方法有农杆菌介导转化法、基因枪法；2、不需要通过组织培养，目前比较成熟的主要有花粉管通道法。,常用的动物转基因技术,1核显微注射法2精子介导的基因转移3核移植转基因法4体细胞核移植法过去的几千年里农作物改良的方式主要是对自然突变产生的优良基因和重组体的选择和利用，通过随机和自然的方式来积累优良基因。遗传学创立后近百年的动植物育种则是采用人工杂交的方法，进行优良基因的重组和外源基因的导入而实现遗传改良。因此，转基因技术与传统技术是一脉相承的，其本质都是通过获得优良基因进行遗传改良。,转基因技术发展情况,一是品种培育速度加快。随着生命科学、基因组学、信息学等学科的发展，目前全球转基
3、因生物新品种已从抗虫和抗除草剂等第一代产品，向改善营养品质和提高产量的第二代产品，以及工业、医药和生物反应器等第三代产品转变，多基因聚合二是产业化应用规模迅速扩大。全球已有25个国家批准了24种转基因作物的商业化应用。转基因大豆、棉花、玉米、油菜为代表的转基因作物种植面积迅速增长。三是生态和经济效益十分显著。1996至2007年，全球转基因作物的累计收益高达440亿美元，累计减少杀虫剂使用35.9万吨。2008年，全球转基因产品市场价值达到75亿美元。,植物：抗虫、抗病、抗除草剂植物培育、改良作物品质（富含赖氨酸的玉米）动物：提高生长速度、生产药物蛋白、器官移植、乳腺生物反应器微生物：疫苗基因
4、治疗，生物治疗，基因诊断，疾病基因的发现与克隆、遗传病的预防,应用,基因敲除(knock-out),定义,利用基因同源重组进行基因敲除,发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous rebination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。同源重组需要一些重组蛋白和酶，如Rec A、B、C、D及DNA连接酶等最为广泛,Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤：两个同源染色体DNA排列整齐一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体通过分支移动产生异源双链DNA
5、Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：,Holiday中间体,片段重组体,拼接重组体,RNA干扰引起的基因敲除,利用随机插入突变进行基因敲除,即基因捕获法：利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。,研究现状,现在基因敲除技术主要应用动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。,文献讲解,技术原理：同源重组的基因敲除,实验目的：用胚胎干细胞为基础的基因打靶技术方法，构建基因敲除（p53）的大
6、鼠模型。,位于10号染色体上，包括10个外显子，其中启动子外显子2上,6.7 kb,1.6 kb,Positive selection,negative selection,PGK-DTA(磷酸甘油酸激酶1-白喉毒素-A链)不参与同源重组，它的随机插入是为了减少含有随机目标媒介插入的耐抗生素型ES细胞，以富集正确的目标细胞。,构建基因载体,DA ES cell,电穿孔法,培养基中加入抗生素,扩增耐抗生素克隆体,PCR和Southern blot analysis,鉴定中靶细胞,obtained 14 p53 gene-targeted DA rat ES-cell clones,相差镜检法,荧
7、光影像,PCR,DAc8-p53-1 ES cell,79 blastocysts（囊胚）,显微注射,嵌合体,pseudo-pregnant female SpragueDawley rats,转移,Twenty-four live-born pups,10 male pups,6 female pups,collected from E4.5 Fischer 344(F344)rats,female SpragueDawley rats,交配,over 600 offspring,one carried the DA rat ES-cell genome,identified by the
8、appearance of agouti coat colour,产24只幼鼠，其中10只公鼠和6只母鼠被着色，说明存在DAc8-p53-1。,PCR genotyping results showed that this germ line animal did not inherit the gene-targeted p53 allele,Failure of mouse ES cells,chromosomal abnormalities in ES cells,over 65%of the cells were polyploid（多倍体）,DAc8-p53-1 ES cell 染色
9、体组型分析,whether germline petency of DAc8-p53-1 rat ES cells could be improved through subcloning,Around 10%of the cells formed round and pact colonies,identified 2 subclones with euploid chromosome numbers,扩增建立亚克隆,inheritance the gene-targeted p53 allele,2 subclones,39 F344 rat blastocysts,显微注射,a germline chimaera,76 offspring,6 germline pups,公,母,9/12,纯合子,summary,1,2,THANKS!,
