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1、高速逆流色谱技术在天然产物分离提取中的应用,概述,高速逆流色谱仪器系统组成及影响因素,在天然产物分离提取方面的应用,前景展望,1.1 定义,是利用混合物不同组分在固定相和流动相中分配系数(或吸附系数、渗透性等)的差异，使不同组分在作相对运动的两相中进行反复分配，实现分离的分析方法。,色谱法,高速逆流色谱,连续高效的液-液分配色谱技术，不用利用任何固态的支撑物或载体。它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相。,1.2 发展史,二十世纪六十年代，首先在日本，随后在美国国家医学研究院发现了一
2、种有趣的现象：即互不相溶的两相溶剂在绕成螺旋形的小孔径管子里分段割据，并能实现两溶剂相之间的逆向对流。ITO及其后来者在此基础上研究并设计制造出了一系列逆流色谱装置，早期的是封闭型的螺旋管行星式离心分离仪CPC（coil planet centrifuge），用于分离染料，蛋白质和细胞粒子。数年后ITO把流通机制引入到螺旋管柱体系中，使逆流色谱和现代色谱一样可以实现连续的的洗脱、分离、检测和收集，并建立了两个基本的流通体制。,1.3 HSCCC的技术特点,1应用范围广，适应性好,2操作简便，容易掌握,3回收率高,4重现性好,5.分离效率高，分离量较大,与HPLC相比：,a.分析成本低b.易于操
3、作c.进样量大,a.溶剂消耗多b.检测限较低,1.4 HSCCC溶剂体系的选择,HSCCC成功分离天然产物的关键就是选择合适的溶剂体系。目前常用分配系数法来选择溶剂体系。分配系数是在体系静止状态下得出的参数,在多数情况下不能反映出HSCCC高速运转的工作状态。,高速逆流色谱常用基本溶剂体系表,2.1 高速逆流色谱系统组成,制备型高速逆流色谱系统具备较大的柱体总容量，适用于实验室和产业化应用的样品分离和提纯。,HSCCC分离流程图,较大的制备型HSCCC，柱容积可达530m1，一次最多进样可达20g粗品；较小的分析型的HSCCC柱容积为8m1，进样量为几十微克，最大转速可达4000r/min，分
4、析能力堪与HPLC相媲美。,2.2 影响因素,2.2.1 固定相的保留值,在逆流色谱中，留在管中固定相的量是影响溶质峰分离度的一个重要因素，高保留量将会大大改进峰分离度。,a.仪器对保留值的影响（外因）研究表明：螺旋管支持件的自转半径r与公转半径R之比B值是一个影响两相互不混溶溶剂在旋转螺旋管内保留的关键因素。用大直径的支持件使值进一步提高，能导致亲水性溶剂体系的单向性流体动力学分布反向；反之，用小直径的支持件使值减小，能使疏水性溶剂体系的单向性流体运动方向反向，而介于疏水性和亲水性溶剂之间的中间极性溶剂，其两相分布状况则会受到离心力条件的影响。,b.溶剂体系物理因素对保留值的影响（内因）溶剂
5、体系的物理因素如溶剂的黏度对固定相的保留影响很大，低黏度的溶剂体系可望得到高的固定相保留，界面张力和两相间的密度差会对溶剂在临界点附近的分层时间产生较大的影响，一般为保证固定相保留值合适，溶剂体系的分层时小于30s。,2.2.2 转速的影响,螺旋管的旋转速度对两相溶剂在流体动力学平衡时的体积比，也就是对固定相的保留值的影响很大，从而影响了分离效果。当然，并不是转速越快越好，一般对于分配得不是太好的溶剂体系，如两相体系带有氯仿的，还要固定相分层比较慢的两相体系，通常情况下转速越高，越易产生乳化现象。,2.2.3 流速的影响,流动相流速也会影响两相的分布，一般情况下，流动相流速越大，固定相流失加重
6、，但流速过慢会导致分离时间过长，从而造成对溶剂的浪费。,2.2.4 温度的影响,温度的提高溶剂的黏度有很大的影响，一般提高温度会获得高的保留值，而相反降低温度则得到低的保留值，但一般温度不可能提高太多，因为所用的都是有机溶剂，沸点很低。,3.在分离天然产物中的应用,从天然产物中提取的活性成分是防治疾病和强身健体的物质基础。从天然产物活性成分中发展新药、寻找先导化合物并进行结构修饰是药物研发的重要内容,目前,许多市场销售和进入临床阶段的抗肿瘤和抗感染药物都来源于天然产物。,3.1黄酮、类黄酮及黄酮苷,黄酮类化合物多存在于高等植物和羊齿类植物中，常以游离或与糖结合成苷的形式存在，在花、叶、果实等组
7、织中多为苷类，而在木质部组织中多为游离苷元。主要包括黄酮、异黄酮、二氢黄酮、儿茶精、花色素等及各种衍生物。利用H S C C C 技术能够很有效的分离提取黄酮类化合物。,利用HSCCC分离黄酮类化合物,3.2苷类(包括皂苷),皂苷在中草药中广泛存在,由于其分子量大,极性较高，因而分离难度较大。20世纪80年代以前,皂苷类化合物的纯化和结构鉴定相对是难度较大的工作。近年来,对皂苷类成分的分离研究取得了较大进展。,3.3生物碱,生物碱是重要的天然含氮化合物,对疾病治疗和药物开发等具有重要意义。近年来,用HSCCC已成功分离了多种生物碱。分离生物碱成分常用的溶剂体系主要有正己烷-乙酸乙酯-甲醇(或者
8、乙醇、正丁醇)-水体系和三氯甲烷-甲醇-水体系、氯仿-甲醇-酸性改性剂体系。,3.4蒽醌类化合物的分离提取,蒽醌类化合物是广泛存在的重要天然色素，在高等植物和真菌、地衣等低等植物中尤为普遍，中药中则以蒽醌及其衍生物最为重要，具有泻下、抗菌、抗癌等生理活性。,3.5 多酚类化合物的分离提取,多酚类化合物在天然产物中广泛存在，具有诸多的生物活性。国人最常饮用的茶叶中，所含茶多酚(主要功效成分儿茶素)就具有抗氧化、抗溶血、抗口臭、抑制致癌物的形成等众多生物活性和保健功能。,3.6 香豆素类化合物的分离提取,香豆素及其衍生物是一类重要的香料，大多具有重要的经济和药用价值。在植物界中，香豆素及其衍生物分
9、布较为广泛。,3.7 其他类化合物的分离提取,4.1 应用方面的研究进展 HSCCC 不仅仅运用在天然产物和中药有效成分的分离提取，而且在食品、蛋白质和多肽、抗生素的分离纯化等方面都有应用。,4.2 技术方面的研究进展 基于常规的HSCCC 技术，随着人们研究运用的深入，人们又发展了多种HSCCC技术。如双向逆流色谱(dual countercurrent chromatography，DuCCC)，正交轴逆流色谱(cross-axis coil planet centrifuge，X-axis CPC)，pH-区带精制逆流色谱(pH-zone-refining CCC)，HSCCC与质谱(MS)联用等。,总而言之，HSCCC技术在国内外的研究中已经被广泛采用。作为一种方兴未艾的优势技术，随着越来越多的研究者的加入，HSCCC 必将更多的用于生命科学、生物医药、食品、化工、材料、环境、地质等工农业生产领域。,Thanks！,
