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1、遗传病的分析5DNA扩增产物的鉴定,限制性内切酶酶切技术 琼脂糖凝胶电泳技术,一、限制性内切酶酶切技术,原 理,限制性内切酶大多由大肠杆菌中提取纯化得到，能特异性识别和切割双链DNA分子中的特异序列（一般识别46个核苷酸序列）由于大多数内切酶具绝对的位点特异性，因此可以选择合适的内切酶切割扩增产物，通过片段大小鉴定基因是否有缺失或缺陷。,原 理,本实验使用限制性内切酶（Lwe I），酶切位点：5.GCATC(N)53 3.CGTAG(N)9.5 正常人样品具有酶切位点，能够被酶切开，分成2个片断；而病人组G则被A替代，酶切位点丧失，不能被酶所切动，所以还是个片断。,器材与试剂,高速离心机、恒温
2、水浴箱、移液枪、枪头、塑料离心管等Lwe I限制性内切酶、三蒸水、缓冲液等,操 作,1、取样品2份（病人、正常人PCR扩增产物）无菌ddH2O 14ul 缓冲液10 2ul 扩增产物 3.5ul 内切酶 0.5ul2、置37oC水浴3h（或过夜）,20ul混匀,注意事项,内切酶需在20环境中保存。内切酶活性的发挥需要Mg2。为使酶反应时达到最佳条件，需使用生产厂商提供的反应条件或缓冲液。,二、琼脂糖凝胶电泳技术,原 理,溴化乙啶（EB）是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖凝胶中的DNA。EB用标准302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号，可用带CCD 摄像头的凝胶成像处理系统拍摄。
3、一定量的DNA加入琼脂糖凝胶，能与凝胶中的EB结合，在TAE介质溶液中，进行电泳。由于电场作用，DNA分子会从负极向正极泳动，分子量小的泳动在前，大的在后，形成不同的DNA条带。此时用紫外透射仪可以检测之。以标准Marker为参照物，可以得知被检DNA的大小。,器材与试剂,紫外透射仪、电泳仪、电泳槽、凝胶板、凝胶梳、橡皮膏、薄膜、移液枪、枪头、塑料离心管等1琼脂糖（含EB）、DNA样品、标准Marker、溴酚蓝溶液、TAE缓冲液等,操 作,1、制备1%凝胶板：配置好的琼脂糖溶液加热溶解后，至50-60 时，浇板；冷却后，置电泳槽内，并轻轻拔出梳子。2、制备上样样品3份（Marker、病人及正常人酶切产物）：每份样品在塑料薄膜上加：溴酚蓝溶液 6 1ul 样品 ul3、点样：吸取混合好的上样样品，轻轻加入琼脂糖凝胶孔内。4、电泳：接通电源（80mA），约30min。5、鉴定：取凝胶置紫外透射仪察看、照相、分析。,混匀,结 果,注意事项,溴化乙啶（EB）是强诱变剂，具有高致癌性！,定义：,细胞培养细胞分裂指数细胞活率细胞的生长曲线细胞周期细胞培养的生命周期细胞系、细胞株细胞“代”微核系谱分析,
