《酶联免疫间接法检测新型冠状病毒S蛋白抗体方法的建立及评价.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酶联免疫间接法检测新型冠状病毒S蛋白抗体方法的建立及评价.docx（8页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、酶联免疫间接法检测新型冠状病毒S蛋白抗体方法的建立及评价曾小平I裴华2朱中元心海南医学院第二附属医院海口570311作者简介：曾小平女检验医师主要从事免疫细胞临床应用研究。朱中元，Email:摘要目的：为建立新型冠状病毒抗体的快速检测方法，用于辅助新冠肺炎诊断及评价疫苗效果。方法:以新冠病毒S蛋白为包被抗原，棋盘滴定法确定包被抗原及样本血清的最佳浓度，通过优化ELISA实验条件，建立起检测新冠病毒抗体ELlSA间接法。以阴性血清确定临界值，并对该法特异性、敏感性、重复性进行验证。结果:棋盘滴定法确定S蛋白包被浓度和样本血清分别为6.4ug/ml和1:100,酶标二抗最适条件为1：1000作用I
2、h,样品和显色液的作用时间分别为45min和30min,CutOff值为0.224。85份新冠疫苗免疫者血液，ELlSA间接法阳性率75.3%(64/85),化学发光法阳性率71.8%(61/85),两者间阳性符合率为85.2%,阴性符合率为50%,总符合率为75.3%批内变异系数5%,批间变异系数15%,结论：以S蛋白为包被抗原建立起的ELISA间接法具有良好的特异性、敏感性和重复性，可用于新冠一面免疫效果评价。关键词：新型冠状病毒；新型冠状肺炎；S蛋白；ELlSA间接法DevelopmentandEvaluationofAnIndirectEnzymeImmunoassayforDetec
3、tingSARS-CoV-2SpikeProteinAntibodiesZengXiaoping1,PeiHua2,ZhuZhongyuanizTheSecondAffiliatedHospitalofHainanMedicalUniversity,HaiKouHainan57031IchinaAbstractObjective:toestablisharapiddetectionmethodofSARS-CoV-2antibodiestoassistinthediagnosisofCOVID-19andevaluationtheefficacyofCOVID-19vaccine.Method
4、s:UsingSARS-CoV-2Spikeproteinasancoatingantigen,andthebestconcentrationoftheantigenandsampleserumwasdeterminedbychessboardtitration.Byoptimizingtheexperimentalconditions,anindirectELISAmethodfordetectingSARS-CoV-2antibodywasestablished.Thecutoffvaluewasdeterminedbynegativeserum.Thespecificity,sensit
5、ivityandrepeatabilityofthemethodwereverified.Results:thecoatingantigenofSproteinandsampleseradeterminedbychessboardtitrationwere6.4gmland1:optimaldilutionofHRP-conjugatewas1:1000whenreactingfor1reationtimeofsampleandchromogenicsolutionwas45minand30min,andthecutoffvaluewas0.224.FromtheCOVID-19vaccine
6、immunizedsamples,thepositiveratesofELISAindirectmethodandchemiluminescencemethodwere75.3%and71.8%.Respectively,thepositiveagreementratebetweenthemwas85.2%,thenegativeagreementratewas50%,thetotalagreementratewas75.3%.theintra-assaycoefficientofvariationwas5%,andtheinter-batchcoefficientofvariationwas
7、6mgL（参考值为0-6mgL）、11例单项类风湿因子20IUmL（参考值为0-20IUmL）、12例单项补体1.4g/L（参考值为0T.4g/L）、2例单项抗链球菌溶血素0200lU/mL（参考值为0-200lUmL）的临床标本。阴性对照组：50例在体检科体检无心、脑、肺、肝等重大疾病的健康体检者。1.2 仪器与试剂新型冠状病毒S蛋白（杭州启泰）；酶标二抗羊抗人IgG-HRP（杭州华得森）ELISA板（上海田源），酶标仪（上海帝肯，型号SUNRlSE）；电热恒温培养箱（北京赛多利斯，型号DHP-42OA）；低速离心机：（安徽中科中佳，型号KDCTO44）；化学发光免疫仪（天津博奥赛斯，型号A
8、XCeed260）和配套的抗体检测试剂盒：其余试剂为实验室现配现用。1. 3方法1.3. 1建立ELlSA间接法1. 3.1.1最佳抗原包被浓度及阳性血清稀释度的确认用0.05molLpH9.6碳酸盐缓冲液将新型冠状病毒S蛋白分别稀释为12.8、6.4、3.2.1.6HgmL,采用棋盘滴定法将S蛋白不同浓度的稀释液加入ELISA板中，100uL/孔，每个浓度做16个孔，4过夜后用200ULPBST溶液洗涤3次，3min孔,加入200uL5%BSA封闭液37C孵育Ih,洗涤方法同上；用0.Imol/LPBS按1：100的比例稀释阳性血清和阴性血清，分别加入不同浓度的ELlSA实验方阵，各100U
9、L/孔，重复做2个孔，孵育方法同上;用0.lmolLPBS按1:1000的比例稀释羊抗人IgG-HRP,100UL用L,同种方法孵育及洗涤后加入显色液A和B各50UL/孔,37C孵育30min后按100口L/孔加入10%HzSOq终止液终止显色，用酶标仪OD网检测，取每个浓度的0怯5。值的平均值。根据OD仅值计算相应的P/N值，当阳性样品OD伽值（P）比阴性样品OD曲值（N）的最大值为最适抗原浓度和血清稀释浓度。1.3.1.2酶标二抗最佳稀释倍数及作用时间的确定以选定的抗原包被浓度和阳性血清稀释度，将羊抗人IgG-HRP用0.lmolLPBS液按1:500、1:1000、1:2000倍稀释，分
10、别加入3块ELlSA板中，37C作用30min、60mir90min,后用酶标仪OD网检测，计算P/N值，取P/N最大值作为最适稀释浓度和作用时间。1.3. 1.3CutOff值的确定在选定条件下，对50份健康体检患者血清进行检测，每份标品重复加2个孔，用酶标仪ODi50进行检测，取OD划平均值，计算所检测样的平均值（X）和标准差（三）,以ODQD值，X+3S计算的值作为CUtOff值。1.4. 1.4交叉性和干扰性实验选取临床诊断明确的社区获得性肺炎、慢性阻塞性肺炎、继发性肺结核、肺部恶性肿瘤的各24例患者血清，通过间接免疫荧光法（IIF）明确29例肺炎支原体IgNk4例副流感病毒IgM.2
11、例乙型流感病毒IgM阳性血清；从住院患者选取20例人为震荡破坏溶血标本、20例脂浊标本、18例黄疸标本、20例C反应蛋白、11例类风湿因子、12例补体、2例抗链球菌溶血素O均升高的临床标本进行检测。1.3.1.5重复性实验批内重复性试验：选择同一时间包被的同一块ELISA板,用本实验建立的ELISA方法同时检测同一批阳性对照品和阴性对照品，每种样品各重复做20孔，计算批内变异系数。批间重复性试验：取3块不同时间包被的ELlSA板,分别编号为1、2、3,分别用同一批阳性对照品和阴性对照品在ELISA板上重复10孔，计算批间变异系数。1.3.1.6临床标本检测应用本实验建立的ELISA间接法，对8
12、5例完成新冠灭活疫苗第二针剂接种的健康体检者的血清进行检测，并与化学发光法检测的结果进行比较。1. 3.2样本采集标本为清晨空腹状态下,干燥管抽取肘静脉血35mL,在2h内4000rpmmin速度离心5min,分离血清后立即采用ELISA间接法与化学发光法同时进行检测。1.3.3结果阳性判断酶联免疫间接法：OD伽值2X+3S；化学发光法:SC01.0o1.4统计方法计数资料以阳性数、阴性数或百分率表示，在对ELISA间接法和化学发光法结果的比较时采用配对资料2检验，交叉性试验和干扰性实验采用四格表资料2检验，结果以产0.05则差异显著，有统计学意义。2结果2. 1ELlSA间接法反应条件经过多
13、次实验数据表明，血清最适稀释比例为1:100,棋盘滴定法确定S蛋白最适反应浓度为6.4口gd（见表1）,酶标二抗最佳稀释度和时间为1：1000时作用Ih,最佳样品和显色液的作用时间分别为45Inin和30min,CutOff值为0.224。表1不同S蛋白包被浓度和血清稀释浓度P/N值稀释倍数血清S蛋白包被浓度（ugmL）1.63.26.412.81:25P/N2.332.1412.0762.8861:50P/N1.8792.4974.0352.0821:100P/N2.0073.5115.1402.1361:200P/N1.8243.9923.8321.7942. 2交叉性和干扰性实验应用本实
14、验建立的ELlSA间接法检测疾病对照组血清，结果显示社区获得性肺炎2例阳性，阳性率为&3%,其余都为阴性，总阳性率为1.5%。见表2。检测干扰对照组血清中，溶血状态标本阳性率为40%,而黄疸和脂浊的标本阳性率则为0对3种不同的状态的标本结果进行四格表资料卡方检验，得出一为17.632,2为0.0001。再分别进行溶血和黄疸两种结果进行四格表资料卡方检验，分别得出Ar?为10和9.12,尸分别为0.002和0.003,P均小于0.05,表明其结果有统计学意义。见表3。表2ELISA间接法检测不同类别的疾病结果类别检测例数阳性数阳性率(%)社区获得性肺炎2428.3继发性肺结核24OO慢性阻塞性肺
15、疾病24OO肺部恶性肿瘤24OO肺炎支原体IgM阳性29OO副流感病毒IgM阳性4OO乙型流感病毒IgM阳性2OO合计13121.5%表3ELlSA间接法检测不同状态的标本标本状态检测例数阳性数阳性率()溶血20840脂浊20OO黄疸18OO合计58813.82. 3重复性实验批内重复性试验：结果显示阳性样品的变异系数为2.21%,阴性样品的变异系数为4.76%,两种样品检测的批内重第性V5%。4.76%,两种样品检测的批内重复性V5%。批间重夏性试验：结果显示阳性样品的批间变异系数为7.10%,阴性样品的变异系数为13.4%,两种样品检测的批间重复性VI5%。2.4临床标本检测通过实验建立起
16、的ELISA方法检测85例完成新冠灭活疫苗第二针接种健康体检者，检出阳性数为64例，阳性率为75.3%。化学发光法检出阳性数为61例，阳性率为71.8%,两者间阳性符合率为85.2%,阴性符合率为50船总符合率为75.3%通过配对资料卡方检验，表明两种检测方法的阳性率无统计学意义（2=0.190,尸二0.663）。见表4。表4ELlSA间接法和化学发光法结果的比较化学发光法酶联免疫间接法合计阳性（+）阴性（一）阳性（+）52961阴性（一）121224合计6421853讨论新型肺炎通过飞沫和密切接触或接触感染患者接触过的物品传播，是呼吸道急性传染病。该病原体SARS-CoV-2传染性强、潜伏期
17、长，随着疫情的发展和对其研究发现，少数患者感染后出现无临床症状，并且继续传播，这类患者称为无症状感染者。该类型患者无典型的新冠肺炎症状，但呼吸道等标本中新型冠状病毒核酸或血清学抗体检测阳性。疫情初始，新冠肺炎主要依靠核酸检测来排除和确诊，但随着疫情的大流行及新冠病毒的变异，核酸检测技术在诊断新冠肺炎的不足逐渐体现出来，标本病毒载量较低、取材不合格、患者就医时处于恢复期，核酸检测会出现假阴性结果。有学者提出血清学抗体检测协同核酸检测可用于辅助C0VID-19的诊断和筛查,血清学抗体检测具有操作简便，不易受标本采集质量影响等优点，现已成为诊断新冠肺炎的主要诊断技术之一。SARS-CoV-2是一种R
18、NA病毒，其基因组编码4种结构蛋白，包括E蛋白（包膜蛋白）、N蛋白（核衣壳蛋白）、M蛋白（膜蛋白）和S蛋白（棘突蛋白），其中S蛋白是病毒进入宿主细胞的关键蛋白，当被新型冠状病毒感染时，S蛋白上的受体结合区（RBD）会识别并结合到宿主细胞表面上的蛋白质受体，从而入侵宿主细胞。利用小分子抑制剂或病人血清能够刺激S蛋白中的受体结合域引发高度有效的中和抗体叫能够显著阻断识别途径，降低病毒的侵染能力力多个领域的研究通过对SARSYOv-2的S蛋白抗原性进行分析，发现S蛋白上抗原位点多，是制备特异性抗体结合的极佳位点”中科院微生物研究所高福院士团队研究的主要针对新冠病毒S蛋白上的RBD的重组蛋白疫苗已经在
19、乌兹别克斯坦上市，美国Novavax公司研发的重组S蛋白纳米颗粒疫苗。Liu等12分别用S蛋白和N蛋白作为包被抗原的试剂盒检测确诊新冠肺炎患者的血清，发现S蛋白抗原的试剂盒IgM/lgG阳性率均高于N蛋白抗原的试剂盒，得出ELlSA的高灵敏度可以用来诊断C0VID-19o本研究以新冠病毒S蛋白为包被抗原建立起新型冠状病毒抗体ELlSA间接法,通过该法检测不同类别的肺部疾病、不同性状标本及不同内源性标本血清进行检测，通过卡方检验得出溶血标本会干扰检测方法,原因为溶血标本中具有过氧化物酶活性的血红蛋白和酶标二抗标记物辣根过氧化物酶结合，导致非特异性显色易造成假阳性，其余干扰条件不会影响该法,表明其
20、具有良好的敏感性和特异性。又以注射新型冠状肺炎疫苗的健康人群为阳性标本,通过本实验建立起的ELISA间接法检测得出的阳性率为75.3%,并与化学发光检测法相比较,化学发光法的阳性率为71.8%,两者间阳性符合率为85.2%,阴性符合率为50乐总符合率为75.3%通过配对资料卡方检验，表明两种检测方法的阳性率无显著差异。与EISlande等1用ELlSA法对2019-nC。VlgG检出率为78.遥相符。目前疫情已常态化，新冠肺炎的抗体检测已经成为必不可少的检测项目，而ELISA间接法检测血清学抗体是国际认可的检测方法，它不仅比胶体金法有更高的敏感性和特异性，同时还比化学发光法更适合于大面积人群检
21、测。参考文献1国家卫生健康委员会官方网站.截至1月31日24时新型冠状病毒肺炎疫情最新情况EBOL.孙晨,何秋霞,高燕,等.现有病毒疫苗用于防治新冠肺炎的可行性分析J.山东科学,2020,33(02):1-11.3苏文豪,张吉翔,熊秋棠，等.新型冠状病毒无症状感染者的临床特征分析J.中华传染病,2020,38(12):772-776.4ChanJF,YuanS,KokKH,etal.Afamilialclusterofpneumoniaassociatedwiththe2019novelcoronavirusindicatingpersontopersontransmission:astudy
22、ofafamilyclusterJ.Lancet,2020,395(10223):514-523.5国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制综合组.新型冠状病毒肺炎防控方案(第七版):联防联控机制综发2020229.(2020-09-15)2020-10-16.6宁雅婷，侯欣，陆旻雅，等.新型冠状病毒血清特异性抗体检测技术应用探讨JOL.协和医学杂志：1-92020-11-17.7 ChaoLH,YeMW,XiaoWL,etal.Clinicalfeaturesofpatientsinfectedwith2019novelcoronavirusinWuhan,ChinaJ.TheLancet
23、,2020,395(10223):497-506.8 WuAP,PengYS,HuangBY,etal.GenomeCompositionandDivergenceoftheNovelCoronavirus(2019-nCoV)OriginatinginChina.J.CllHostMicrob,2020,27(3):325-328.9 BhattacharyaM,SharmaAR,PatraP,etal.Developmentofepitope-basedpeptidevaccineagainstnovelcoronavirus2019(SARS-COV-2):ImmUnoinformati
24、CSapproach.J.JMedvirol,2020,92(6):618-631.10何金娇,刘洋洋,毛雪飞,等.SARS-Co2S蛋白结构与功能的生物信息学分析JOL.基因组学与应用生物学：1-1920210615.12 11李晓瑞,李兴航,严汉池.新型冠状病毒疫苗的研发现状及展望J.中国生物制品学杂,2021,34(05):602-606.13 1.iuWB,LiuLKouGM,etal.EvaluationofNucleocapsidandSpikeProtein-BasedEnzyme-LinkedImmunosorbentAssaysforDetectingAntibodiesag
25、ainstSARS-CoV-2.JJ.Clin.Microbiol.,2020,58(6).13曹向红，董玉琳，徐敏.酶联免疫吸附试验的干扰因素和对策J.实用医技杂志,2011,18(12):1321-1322.14 VanElslandeJ,HoubenE,DepypereM,etal.DiagnosticperformanceofsevenrapidIgG/IgMantibodytestsandtheEuroimmunIgA/IgGELISAinCOVID-19patients.J.Clinicalmicrobiologyandinfection:theofficialpublicationoftheEuropeanSocietyofClinicalMicrobiologyandInfectiousDiseases,2020,26(8):1082-1087.
