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1、第七章 酶非水相催化,观念的改变,有关酶的催化理论是基于酶在水溶液中的催化反应建立起来的。近年来，进行了非水介质的酶结构与功能、酶作用机制、酶作用动力学的研究，建立起非水酶学（non-aqueous enzymology)。,第一节 酶非水相催化的研究概况,受非水介质的影响，其催化特性与在水相中不同。,酶的非水相催化主要包括:,一、有机介质中的酶催化；二、气相介质中的酶催化；三、超临界流体介质中的酶催化；四、离子液介质中的酶催化,一、有机介质中的酶催化,指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。适用范围:底物、产物两者或其一为疏水性物质的酶催化作用。原因:酶在有机介质中基本能保持结构的完整
2、。特性:酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、键选择性、热稳定性等有所改变。应用：多肽、酯类、甾体转化、功能高分子合成、手性药物拆分的研究。,二、气相介质中的酶催化,指酶在气相介质中进行的催化反应。适用范围：底物是气体或能转化为气体的物质的酶催化反应。特性：气体介质的密度低，扩散容易，与在水相中明显不同。,三、超临界流体介质中的酶催化,酶在超临界流体中进行的催化反应。超临界流体是指温度和压力超过某物质的超临界点的流体。,要求：超临界流体对酶结构无破坏；具良好化学稳定性；温度不可太高太低；压力不可太高；易获得等。常用的超临界流体有：CO2,SO2 C2H4,C2H6 C3H8 C4H10 等。
3、,四、离子液介质中的酶催化,指酶在离子液中进行的催化作用。离子液(Ionic liquid)是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的、在室温下呈液态的低熔点盐类，挥发性低，稳定性好。特性：酶在其中有良好的稳定性、区域选择性、立体选择性、键选择性。,第二节有机介质中水和有机溶剂对酶催化反应的影响,1、微水介质体系；2、与水溶性有机溶剂组成的均一体系；3、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系；4、（正）胶束体系；5、反胶束体系。,一、有机介质反应体系,1、微水介质体系,是由有机溶剂和微量的水组成的反应体系。微量的水主要是酶分子的结合水,对维持酶分子空间构象和催化活性至关重要。另一部分水分配在有机
4、溶剂中。酶以冻干粉或固定化酶的形式悬浮于有机介质中，是常见的有机反应体系。,2、与水溶性有机溶剂组成的均一体系,由水与极性较大的有机溶剂互相混溶组成的反应体系。水与有机剂含量均较大。适用的酶较少。,3、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系,由水和疏水性较强的有机溶剂组成的两相或多相反应体系；游离酶、亲水性底物或产物溶解于水相，疏水性底物或产物溶解于有机溶剂相。固定化酶在界面；催化反应在两相界面进行；适于底物或产物两者或其中一种属于疏水化合物的催化反应。,4、正胶束体系,大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂，加入表面活性剂后形成的水包油的微小液滴。表面活性剂的极性端朝外,非极性端朝内,有
5、机溶剂被包在液滴内部。酶在胶束外面的水溶液中,疏水性的底物或产物在胶束内部,反应在胶束的两相界面中进行。,5、反胶束体系,反胶束:在与水不互溶的大量有机溶剂中,加入表面活性剂后形成的油包水的微小水滴；1997年首次报道酶在反相胶束中具有活性(已发现40多种酶)；酶分子处在反胶束内，稳定性好；反胶束与生物膜有相似之处，适用于处在生物膜表面或与膜结合的酶的结构、催化特性和动力学性质的研究。,二、水对有机介质中酶催化的影响,有机溶剂中酶的催化活力与反应系统的含水量密切相关。系统含水量:结合水(酶粉水合、固定载体和其他杂质)、游离水(溶于有机溶剂)与酶结合的水量是影响酶的活力、稳定性以及专一性的决定因
6、素,1、水对酶分子空间构象的影响,无水下酶空间构象被破坏,故需一层水化层;必需水:维持酶分子完整空间构象所必需的最低水量;不同的酶所需求的必需水的量差别较大;每分子凝乳蛋白酶只需50分子的水，每分子多酚氧化酶却需3.5102个水分子原因:必需水是维持酶分子结构中氢键、盐键等副键所必需的。,2.水对酶催化反应速度的影响,典型的非水酶体系中水含量通常只占0.01%，但其微小差距会导致酶催化活力的较大改变。水影响蛋白质结构的完整性、活性位点的极性和稳定性。,三、有机溶剂对有机介质中酶催化的影响,直接或间接影响酶的活性和稳定性。改变酶的特异性（底物特异性、立体选择性、前手性选择性等）。通过与水、酶、底
7、物和产物的相互作用来影响酶的特性。,1.有机溶剂对酶结构与功能的影响,在水溶液中酶分子均一地溶解在水溶液中，较好地保持其构象；有机溶剂中酶分子不能直接溶解，因此根据酶分子特性与有机溶剂特性不同，其空间结构的保持也有不同。有些酶在有机溶剂作用下，其结构受到破坏；有的酶分子则保持完整；,（1）有机溶剂对结合水的影响,一些相对亲水性的有机溶剂能够夺取酶表面的必需水而导致酶失活。由于酶与溶剂竞争水分子，体系的最适含水量与酶的用量及底物浓度有关。提高酶分子的亲水性，可以限制酶在有机溶剂中的脱水作用。,2.有机溶剂对酶活性的影响,、溶剂对底物和产物分配的影响,溶剂能直接或间接地与底物和产物相互作用。溶剂能
8、改变酶分子必需水层中底物或产物的浓度。有机溶剂极性小，疏水性强，则疏水性底物难于进入必需水层；有机溶剂极性过强，亲水性强，则疏水性底物在有机溶剂中的溶解度低。故选择2lgp5的有机溶剂作为有机介质为宜。,第三节 酶在有机介质中的催化特性,有机溶剂的存在,改变了疏水相互作用的精细平衡,从而影响到酶的结合部位。有机溶剂会改变底物存在状态。结果影响酶的稳定性和酶的底物特异性,立体选择性,区域选择性和化学键选择性。,2、底物特异性 酶在有机溶剂中对底物的化学结构和立体结构均有严格的选择性。例如：青霉脂肪酶 在正己烷中催化2-辛醇与不同链长的脂肪酸进行酯化反应时，该酶对短链脂肪酸具有较强的特异性。,一、
9、底物专一性,(1)有机介质中酶活性中心结合部位与底物的结合状态发生改变,致使酶的底物特异性发生改变:水溶液中底物与酶活性中心结合靠疏水作用;有机介质中有机剂与底物的疏水作用更强;,(2)不同的有机介质，酶的底物专一性也不一样:极性较强的有机溶剂中,疏水性较强的底物易反应;极性较弱的有机溶剂中,疏水性较弱的底物易反应;,3、对映体选择性 酶的对映体选择性是指酶识别外消旋化合物中某种构象对映体的能力。有机溶剂中酶对底物的对映体选择性由于介质的亲（疏）水性的变化而发生改变。疏水性强的有机溶剂中酶的立体选择性差。例如：某些蛋白水解酶在有机溶剂中可以合成D氨基酸的肽，而在水溶液中酶只选择L-氨基酸。,二
10、、对映体选择性（enantioselectivity),对映体选择性意义：例如：某些蛋白水解酶在有机溶剂中可以合成D氨基酸的肽，而在水溶液中酶只选择L-氨基酸。,三、区域选择性（regioselectivity）,酶能够选择性地催化底物分子中某个区域的基团优先发生反应；用区域选择系数的大小衡量。用1、2代表底物分子的区域位置；区域选择系数：K1，2=（kcat/Km)1/（kcat/Km)2,例：,四、键选择性（chemoselectivity),即同一个底物分子中有2种以上化学键可与酶反应，酶对其一优先反应。,6-氨基-1-已醇,黑曲霉脂肪酶,毛霉脂肪酶,羟基酰化,氨基酰化,占优,五、热稳定
11、性 有机溶剂中酶的热稳定性和储存稳定性都比水溶液中高。例如：猪胰脂肪酶（PPL）在苯中催化酯交换反应时，（1）酶活性随温度升高（2070）而增加，（2）在70连续反应7次（每次96 h）后酶活力仍保持 60，（3）在100时的半衰期可达数十小时，而在水中100几乎马上失活。PPL的稳定性取决于有机溶剂中水的浓度，1的水，会使PPL的稳定性降低到和水溶液中相同的水平。,六、pH值特性,在有机介质中酶所处的pH环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液pH值相同，称为pH印记或pH记忆（pH-imprinting）;现象：脂肪酶催化三丁酸甘油与正庚醇的转酯反应，酶的反应速度与其冷冻干燥前水溶液
12、的的PH密切相关，反应的最适PH接近于水溶液中的最适PH,原因：当酶分子从水溶液转移到有机介质时，原有的解离状态不变，被保持在有机介质中；有机介质中酶催化反应的最适ph通常与在水溶液的pH接近；但有些有机溶剂中酶的最PH与水溶液中相差较大，还与缓冲液种类和离子强度有关;,第四节 有机介质中酶催化反应的条件及其控制,酶在有机介质中的催化反应受各种因素影响，主要有酶、底物、有机溶剂种类、水含量、温度、pH值和离子强度等。,一、有机介质中酶催化反应的类型,1、合成反应2、转移反应3、醇解反应4、氨解反应5、异构反应6、氧化还原反应7、裂合反应,1、合成反应,有机介质中水含量极微，可催化水解反应的逆反
13、应；（1）脂肪酶或酯酶催化有机酸和醇进行酯的合成反应：,意义:酶催化酯合成可合成手性化合物,且酶的立体选择性主要是选择立体异构的醇。,（2）蛋白酶可在有机介质中催化氨基酸进行合成反应，生成多肽,2、转移反应,如脂肪酸催化酯与有机酸反应生成另一种酯与有机酸,即转酯反应：,3、醇解反应,假单胞脂肪酶催化酸酐醇生成二酸单酯化合物,即酸酐水解反应,例:,4、氨解反应,如脂肪酶催化酯类进行不对称氨解反应：,R-苯丙氨酸甲酯,酰胺,叔丁醇,5、异构反应,如消旋酶催化一种异构体为另一种异构体,例,6、氧化还原反应,（1）单加氧,（2）双加氧,（3）催化醛类或酮类还原成醇类,（1）单加氧,（2）双加氧,（3）
14、催化醛类或酮类还原成醇类,7、裂合反应,如醇腈酶催化醛与氢氰酸的反应,二、酶的选择,1、不同酶具不同结构和特性，同一种酶由于来源、处理法不同特性亦有差别；2、酶反应速度与酶浓度成正比；3、另注意酶的稳定性、底物专一性,对映体选择性、区域选择性、键选择性等,三、底物的选择和浓度控制,1、有机剂与水中酶的底物专一性不同；2、底物浓度对酶催化速度有明显的影响；3、有机介质中要考虑底物在有机溶剂和必需水层中的分配情况；4、高浓度底物会对反应产生不利影响。,四、有机溶剂的选择,1、有机剂的极性要选择恰当：极性过强,夺取较多酶表面水分子,使疏水性底物溶解度降低;极性过弱,底物难以进入必需水层;故取中间:2
15、lgP5,2、与水混溶的有机介质其含量对酶催化有影响。与水混溶的二氧六环介质,辣根过氧化酶(HRP)催化对苯基苯酚的聚合反应,随着二氧六环的含量增加,酶催化得到的聚合物的分子量也增加,80%时最大。,五、含水量的控制,当其它因素不变时，系统含水量对酶活性有影响，只有在最适含水量时酶才有最高活力；最适水含量通常随溶剂极性增大（lgP减小）而增大；,1,1-已烷2-四氯甲烷3-甲苯4-苯,六、温度的控制,1、微水有机介质中含水量低，酶的热稳定性增强，其最适温度高于水溶液中催化的最适温度；2、温度低，酶的立体选择性高。Lam和Keinan的实验结果支持此结论；,七、pH值的控制,酶在有机介质中的最适
16、PH值通常与在水溶液中催化的最适pH相同或接近；可通过调节缓冲液pH的方法调节有机介质中酶催化的pH值；酶在冷冻干燥过程中，pH状态有变化；希令（hilling)发现缓冲液对冷冻干燥过程中pH值和酶活力有影响，故加入一定量的蔗糖、甘露醇等冷冻干燥保护剂；在酶液冻干之前或催化过程采取保护措施；加有机相缓冲液可对有机介质中酶反应的pH调节。,第五节酶非水相催化的应用,酶非水相催化应用,一、手性药物的拆分,手性化合物指化学组成相同而立体结构互为对映体的两种异构化合物；手性药物指只含单一对映体的药物；已经发现很多手性药物的对映体具有不同的药理作用。过去手性药物多较是以消旋体形式出售。1961年欧洲出现
17、了孕妇服用多消旋体的“反应停”后，产生多起畸形胎事件。1992年美国食品与药物管理局（FDA）明确要求含手性因素的化学药物，必须说明其二个对映体在体内的不同生理活性，药理作用和药物代谢动力学情况。1994年以来，手性药物世界销售额以年20以上的速度增长。目前，世界上批准上市约61种。,手性药物两种对映体的药理作用,1、手性药物两种对映体的药效差异,（1）一种有疗效，另一种很弱；（2）一种有效，另一种有不良反应；（3）两种相反；（4）两种各有不同药效；（5）两种消旋体作用具互补性,分5种类型：,2、酶在手性化合物拆分方面的应用,酶催化在单一对映体手性药物的开发中潜力颇大。1、阻断剂类手性药物 2
18、、非甾体抗炎剂类手性药物 3、5羟色胺拮抗物和摄取抑制剂类手性药物脂肪酶在拆分中起重要作用。其他种类酶（如酯酶、过氧化物酶、醇脱氢酶等）也能进行拆分反应，但因这些酶不易获得，价格昂贵或需要辅酶而较少研究。,1、阻断剂类手性药物拆分,(1)普萘洛尔的酶法拆分Berinakatti在有机剂中用PSL(假单胞菌脂肪酶对外消旋萘氧氯丙醇酯水解,得到-酯的ee值大于95%,PSL对外消旋萘氧氯丙醇酯水解反应路线图,(2)环氧丙醇酶法拆分在阻断剂类手性药物中,环氧丙醇是很重要的3碳手性中间体,还可合成治艾滋病的HIV蛋白酶抑制剂,抗病毒药(S)-HMPA等手性甘油磷脂;Vantol对2,3-环氧丙醇的丁酸
19、酯在有机剂中与两相体系中用PPL(猪胰脂肪酶)进行酶促拆分.,*,脂肪酶水解反应拆分丁酸环氧丙酯，*手性碳位置,2、非甾体抗炎剂类手性药物拆分,非甾体抗炎剂类手性药物广泛用于人联结组织疾病如关节炎,活性成分是2-芳基丙酸的衍生物(CH3CHArCOOH),如萘普生,布洛芬等。台湾的Tsai证实在80%异辛烷与20%甲苯中酶反应获得较高ee值光学活性物。,布洛芬酶法拆分示意,3、羟色胺拮抗物和摄取抑制剂,5-羟色胺(5-HT)是涉及到精神病、神经系统紊乱的一种神经递质；一些药物的毒性在于其不能选择性地与5-HT受体反应；一种新的5-HT拮抗物（MDL）则显示了极好的选择性，（R）型活力是（S）型
20、的100倍；手性拆分如下，脂肪酶选择性催化生成(R,R)酯，残留为（S，S）醇,二、手性高分子聚合物的制备,光学活性化合物：具有旋光性质的化合物，也称手性化合物。意义：构成生物体的基本物质，如氨基酸、蛋白质、核酸、糖类等生物大分子都是手性化合物，手性对生物体的新陈代谢有重要意义。与此相关的药物、生理活性物质、农药合除草剂也都是光学活性化合物，其药理和生理作用多与它们生物体内靶分子之间的手性匹配合分子识别能力有关。光学活性化合物的制备是有机合成的难题。酶可用于光活性物质的合成拆分。,（一）光学活性化合物的制备,随着具有光、电、磁性聚合物的发现，旋光性聚合物正受青睐。旋光性聚合物广泛存在于自然界中
21、，多由蛋白质、核酸、多糖等构成。聚合物的旋光性来源于单体单元中含有的手性元素或聚合物的手性构象，或这两者的共同作用。影响高分子材料物理性能及加工性能，不仅在于其一级结构，其二三级高级结构也是重要因素，聚合物旋光性（手性）也是一个重要因素；利用酶催化获得高的立体选择性，化学催化提供高产率，特性合成手性聚合物是一条很有应用潜力的新途径。,旋光性高分子,旋光性聚合物与具有相应结构的非旋光聚合物相比，在分子识别和组装上具明显区别，在熔点、溶解性、结晶特性上有较大差异，在光、电、磁上也有差异。利用水解酶可合成多种手性聚合物；酶法可获得较高立体选择性，化学催化法有较高产率，两者结合较有前景。,（二）酶催化
22、合成可生物降解高分子,可生物降解高分子是指在一定条件下能被生物体侵蚀或代谢而降解的材料，应用广泛：,1.聚酯类可生物降解高分子的酶促合成,A、B各代表一种具有反应性的功能基因，如羟基和羧基、羧基和酰氯等；Gaonkar等认为：极性太强的溶剂对聚合反应不利，因为随着聚合反应的进行，聚合物的聚合程度逐渐增加，聚合物的极性逐渐降低，它在强极性溶剂中的溶解度液随之降低，不利于聚合的进行。,(1)利用线性单体的缩合反应合成聚酯,近两年发展的新方法MacDonald认为：水分子在链增长的过程中起到了活化作用，聚合反应过程先是一个快速的起始反应，然后是缓慢的链增长过程。,（2）利用内酯的开环聚合反应合成聚酯
23、,糖和类固醇的选择性酰化,糖酯作为一种生物功能分子和化工原料具有重要价值。1991年Planehon发现一些糖酯衍生物具有抗肿瘤作用。对糖的多羟基位置选择性酯化是有机合成化学中的难题，利用生物催化剂的高度选择性易于解决。1986年Klibanov小组首先开展了有机相中酶结合成糖酯的研究。利用糖的特殊的分子结构合成糖基聚酯或高交联度的聚酯是研究热点之一酰基对于糖酯的合成至关重要。,2、聚糖酯类可生物降解高分子的酶促合成,酶法合成该性天然多糖的主要途径大多是在聚酯链上引入糖基，以增强聚合物的生物可降解性能。如果用化学方法聚合，需要将有些羟基保护起来，避免副反应，聚合后，再脱保护，反应过程复杂，还有
24、异构体产生，酶法聚合则不必保护基团，反应条件温和。,三、酚树脂的合成,辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）能以H2O2为电子受体，专一催化酚及苯胺类物质的过氧化反应；起始阶段，酶催化酚类物氧化成酚氧自由基；然后是自由基聚合阶段；然后是单体自由基与二体自由基发生传递，使聚合物链增长,辣根过氧化物酶催化酚类物质的合成,酚树脂通常是在甲醛存在下缩合酚类物质而获得的。辣根过氧化物酶（HRP）催化产生的酚类聚合物无甲醛污染。HRP可催化酚类物质与天然的树脂材料木质素混聚形成酚树脂。,back,四、导电有机聚合物的合成,1977美国，Macdiarmid打破聚合物系绝缘体
25、观念，获得碘掺杂的聚乙炔；酶法合成的聚酚胺类物质具有电子共轭结构，通过掺杂表现出一定的导电性。有机酶合成用于研制有机导电聚合物，如聚苯胺，抗雷电袭击、抗静电、抗磁干扰、雷达微波吸收。HRP在催化合成聚合物方面是一种应用较多，潜力较大的酶，HRP能够以过氧化氢为电子受体，专一地催化酚及苯胺类物质的过氧化反应。,辣根过氧化物酶催化酚及芳香胺类物质的聚合,（1）在混合溶液中聚合：HRP可以在含水量不同的与水混溶的有机介质中进行催化反应，可以获得高质量的聚合物。（2）在胶束中进行催化反应，酶能够保持极高的反应活力。,合成方法,五、发光有机聚合物的合成,非线性光学材料是激光技术的重要物质基础，在激光倍频
26、、混频、参量放大与振荡、集成光学、光信息处理与光信号控制、光电子计算机等方面有重要应用；有机非线性光学材料其倍频效应较无机材料高几百上千倍；前者光学效应缘于非定域电子体系，激发响应时间较无机材料快1000倍；非线性光学材料：酶法合成的聚酚类物具有较高的三阶非线性光学系数X（3）非定域电子共轭聚合物：HRP催化聚合的产物可以产生一些发光较好的聚全物，有可能在发光二极管方面有所应用。,辣根过氧化物酶催化酚及芳香胺类物质的聚合3,六、食品添加剂的生产,1、利用脂肪酶或酯酶催化生成酯类；2、利用嗜热菌蛋白酶生产天苯肽；3、利用芳香醛脱氢酶生产香兰素；,生成酯类,利用脂肪酶将甘油三酯水解成单酯，是食品乳
27、化剂。,天苯肽,天苯肽是二肽甲酯，是食品甜味剂，甜度是蔗糖的150200倍；通过嗜热菌蛋白酶在有机介质中合成,香兰素,通过微生物发酵得到香兰酸，再经脱氢酶还原得之。它的年产量仅有20 t，而世界每年需求量为12000t。,七、生物柴油的生产,石油短缺；传统能源的日益枯竭需要开发可再生能源；环境保护与汽车工业的发展需要清洁油料；液体燃料的不足已严重威胁到我国的能源与经济安全；生物柴油是动物、植物或微生物油脂与小分子醇类经酯交换反应而得的脂肪酸酯类物可代替柴油；生物柴油可生物降解，无毒性，对环境无害，并可以从可再生资源中提取。,意义,生物柴油制造方法,用动物和植物油脂和甲醇或乙醇等低碳醇在酸碱下高
28、温（230250）催化转酯反应,生成相应的脂肪酸甲酯或乙酯，在经洗涤干燥即得生物柴油,生产设备与一般制油设备相同,后处理复杂，废酸碱二次污染；,化学法,有机介质中脂肪酶催化油脂与小分子醇类进行酯交换反应生成小分子酯类混合物；,酶法,八、多肽的合成,（1）-胰蛋白酶催化N-乙酰色氨酸与亮氨酸合成肽的反应，在水溶液中合成率在0.1%以下，而在乙酸乙酯和微水组成的两相系统中，合成率可达100%。（2）嗜热菌蛋白酶有机介质中催化L-天冬氨酸与D-丙氨酸缩合成天丙二肽（3）脂肪酶催化青霉素前体等多肽的合成,九、甾体转化,甾体在水中溶解度低，反应受限制；在有机相与水两相中大提高转化率；如：可的松转化为氢化可的松的酶促反应，在水-乙酸丁酯或水-乙酸乙酯组成的系统中，转化率达100%和90%。,谢谢观赏！,
