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1、第四篇 遗传与变异,23 重组DNA技术,基因重组：自然界随机发生；人为操作有目的,往往引入外源基因。,23 重组DNA技术,23 重组DNA技术,重组DNA技术，也称基因工程或遗传工程。基因工程是指将特定的基因（即外源基因），通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受体细胞中与受体细胞的基因进行重组，并能增殖、表达，这样一种遗传学操作。基因工程的主要目的:通过与优良性状相关的基因的重组，获得具有高度应用价值的新物种或新产品。,基因工程的优点 A.克服物种间的屏障；B.有目的、有计划、有选择地加工制造各种生物制品；C.遗传育种、医学等研究和开发。,23 重组DNA技术,23 重组DNA技术,重
2、组DNA技术,23 重组DNA技术,基因工程,23 重组DNA技术,23.1 基因工程的相关技术23.1.1 核酸的分子杂交1.DNA的变性与复性DNA变性较高温度DNA解链成单链。DNA复性变性的DNA逐渐冷却，分离的两条单链通过碱基互补配对重新恢复成双链的DNA分子。短链容易精确复性；长链复性较难。杂交分子不同来源的单链DNA，只要碱基序列大部分互补，就可以复性。DNA与RNA之间，也一样可以通过碱基互补配对形成杂交双链分子。,23 重组DNA技术,2.分子探针寻找特定基因放射性标记的DNA或RNA分子。3.Southern印迹 可以检测特定的DNA序列。,23 重组DNA技术,South
3、ern印迹,23 重组DNA技术,4.Northern印迹 可以检测特定基因的表达情况。5.原位杂交 可以检测特定细胞中某一基因的表达情况。,23 重组DNA技术,23.1.2 PCR1.PCR技术的基本原理PCR反应过程：双链DNA变性（9095）成为单链DNA；引物复性（37-60）同单链DNA互补序列结合；DNA聚合酶催化（70 75）使引物延伸。,23 重组DNA技术,PCR原理,23 重组DNA技术,2.Taq DNA聚合酶 耐热3.寡核苷酸引物4.PCR技术的应用基因克隆、特定DNA序列鉴定（基因鉴定、DNA指纹识别）,23 重组DNA技术,23.2 基因工程主要的工具酶23.2.
4、1 限制性内切（核酸）酶（1）限制性内切酶的作用识别DNA中特定核苷酸序列，使每条链的一个磷酸二酯键断开。（2）限制性内切酶的类型I型、II型和III型。II型酶基因工程。（3）限制性内切酶的命名根据来源命名。如EcoR I 大肠杆菌（E.coli）、R株系、第一种。,23 重组DNA技术,（4）限制性内切酶的识别序列 能识别的特定核苷酸序列。46个碱基对组成，且碱基互补对称。只写单链的核苷酸序列。（5）限制性内切酶的切割位点II型酶切割位点在识别序列区内。,23 重组DNA技术,（6）切割片段的末端A.粘性末端两条链末端交错对称。5 粘性末端 3 粘性末端 B.平头末端 两条链末端平齐。,2
5、3 重组DNA技术,粘性末端,23 重组DNA技术,23.2.2 DNA连接酶催化-PO4和-OH形成磷酸二酯键。（1）E.Coli DNA连接酶大肠杆菌（E.Coli）基因组编码；连接具互补粘性末端的DNA片段。（2）T4 DNA连接酶T4噬菌体DNA编码；既连接具互补粘性末端的DNA片段，也能连接平头末端。,23 重组DNA技术,23.2.3 反转录酶从反转录病毒中制备得到的。该酶能以具有3-OH 的DNA或RNA为引物，以mRNA为模板从53聚合生成cDNA。,23 重组DNA技术,23.3 基因(克隆)的质粒载体基因载体运送外源DNA片段进入受体细胞。需具备三个条件：有插入位点；能在受
6、体细胞内复制；有筛选标记基因。,23 重组DNA技术,质粒A.存在于细菌；蓝藻、绿藻、真菌。B.染色体外裸露环状双链DNA分子，小的不足1500bp，大的100kb以上。C.宿主细胞内能自主复制。分为松弛型和严紧型复制两种类型质粒。选用分子小和松弛型复制的质粒（即有高的拷贝数）。,23 重组DNA技术,质粒载体pBR322A.有复制起始点，能在受体细胞内复制；B.有2种筛选标记基因；C.有允许外源DNA插入的位点；D.有高的拷贝数。,23 重组DNA技术,pBR322图谱,23 重组DNA技术,23.4重组DNA的基本步骤23.4.1 获得目的基因1.构建基因组文库分离目的基因2.人工合成DN
7、A3.利用反转录酶构建cDNA文库分离目的基因4.用PCR技术从基因组中扩增特定的基因片段,23 重组DNA技术,23.4.2 DNA分子的体外重组酶切和连接。,23 重组DNA技术,23.4.3 重组DNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定1.重组DNA引入宿主细胞原核生物细胞是很好的受体细胞容易摄取外界的DNA，增殖快，基因组简单，便于培养和基因操作。大肠杆菌、蓝藻、农杆菌等。2.重组体克隆的筛选与鉴定抗性筛选；鉴定的证据越充分越好。,23 重组DNA技术,转基因植物筛选,23 重组DNA技术,阳性克隆的PCR鉴定,23 重组DNA技术,转GFP动物,23 重组DNA技术,转GFP植物,23 重组
8、DNA技术,23.5 基因工程的应用及其成果简介基因工程干扰素、人生长素、人胰岛素、乙肝疫苗、红细胞生成素、血纤维蛋白溶酶原激活剂（溶栓药）等。基因工程农作物新品种也已在一些国家在大田种植，如抗虫棉、抗虫玉米、耐储黄瓜等。1.生产新型疫苗2.生产人胰岛素3.生产人生长素4.生产干扰素,23 重组DNA技术,5.动、植物基因工程转基因动物（1）模式动物 模式动物可用来揭示生物学困难领域中的许多奥妙，像人脑、免疫系统和胚胎发育等。在试验遗传病的新疗法中，模式动物也很有用。癌鼠；转基因猴。,模式动物,23 重组DNA技术,23 重组DNA技术,（2）生物反应器动物生物反应器动物：利用其乳腺分泌药用蛋
9、白质来制药的转基因动物。羊-乳球蛋白启基因动子、-抗胰蛋白酶。（3）供体动物英国科学家在1992年12月成功培育出转基因猪，其心脏带有人类的成分；猪心脏来代替人心脏用于移植手术。,23 重组DNA技术,转基因植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆、作物的高产优质、果蔬储存、作物的固氮能力、药物生产及环境美化等。（1）抗虫植物 苏云金杆菌、毒蛋白（在昆虫碱性肠道中水解成有毒性的小肽）。,23 重组DNA技术,（2）抗除草剂植物草甘磷是一种广谱除草剂。它的靶位点在叶绿体中的EPSP合成酶。由于阻断芳香族氨基酸的合成，植物最终会死亡。细菌中分离到的一个突变株有EPSP合成酶突变基因。此基因抗草甘磷，引入此基
10、因后，已得到抗性植物。这样施用草甘磷，可杀死除转基因植物外的所有植物。psbA编码（光基因32）D1蛋白。该蛋白是除草剂Atrazine等的结合受体。若#264 aa发生丝氨酸为甘氨酸取代，植物成为抗性型。利用这一特点，已成功培育出抗阿特拉津的作物。,23 重组DNA技术,（3）改良药用植物日本科学家用重组DNA技术提高了镇静药莨莞碱合成的效率。莨莞碱合成率取决于H6H酶。克隆天仙子H6H酶的cDNA，然后用Ti质粒把CaMV35S H6H导入颠茄。常规颠茄天仙子碱很少能转化成莨莞碱，而导入H6H酶基因后，它们100%转化。收率从0.3%提高到1%，而且这一特性可传给后代。（4）生产疫苗的植物
11、土豆生产疫苗。,23 重组DNA技术,6.基因诊断和基因治疗1990年，首例应用基因治疗，治愈一名四岁女孩的腺苷脱氨酶缺乏症。采用逆转录病毒转移腺苷脱氨酶基因。基因治疗基因：单基因疾病基因导致腺苷脱氨酶缺乏症、镰刀形贫血病等；肿瘤抑制物基因和肿瘤形成基因等。腺病毒、脂质体和单疱疹病毒等作为载体囊性纤维化病、帕金森氏病。爱滋病和癌症。,23 重组DNA技术,人类胚胎发育早期和基因诊断,转基因技术在基因表达调控研究中的应用,23 重组DNA技术,23 重组DNA技术,23.6 遗传工程的风险和伦理学问题1.对人的影响“超级细菌”、对宗教、习俗和生活方式的影响。用抗菌素抗性基因整合的转基因食品的利用，遭到一部分人的反对。因为人们担心以后会有太多的抗抗菌素生物产生，甚至产生无法对付的超级病菌。,23 重组DNA技术,2.对环境的影响 转基因的逃逸；超级细菌；超级杂草；对生物多样性的影响。利用抗除草剂基因筛选的办法，也由于人们担心会产生超级杂草，而遇到类似的情况。3.严格的释放规定 生物安全实验室规则。,
