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1、重组基因导入到受体细胞,生物与食品工程学院,受体细胞,能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。受体细胞应具有的特性：1.便于导入2.能使重组DNA分子稳定存在于细胞中3.便于筛选4.密码子使用没有明显的偏倚5.安全性高并不是所有的细胞都可以用来做受体细胞,原核受体细胞,1.没有核膜2.基因组简单便于对引入的外源基因进行遗传分析3.容易获得一致性的实验材料单细胞,原核受体细胞,大肠杆菌（E.coli）优点：1.研究背景清楚2.繁殖迅速培养简单缺点：1.可引起人体致病2.缺少加工后修饰 目前商品化的基因工程产品多数是大肠杆菌生产的人胰岛素、生长素、干扰素,原核受体细胞,枯草芽孢杆菌能将基因表达产物分
2、泌到培养基中一般可表达真核蛋白无致病性可以形成芽孢，方便培养和保存,原核受体细胞,蓝细菌含叶绿素，能进行光合作用，营养要求低。基因组简单，遗传背景清楚。可以成为植物基因表达的宿主。,真核受体细胞,酵母菌结构最为简单的真核生物，背景清楚具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统使用历史悠久，不产生毒素，安全有保障培养简单能将外源基因表达产物分泌到培养基中,真核受体细胞,植物受体细胞有细胞壁，但可通过纤维素酶降解原生质体在特定条件下培养，可再生细胞壁，进行细胞分裂。植物细胞具有全能性，可以通过一个细胞培养出稳定的植株。,真核受体细胞,动物受体细胞全能性较差，多采用胚胎细胞作为受体细胞。优点：能识别内含子有
3、翻译后加工修饰功能,真核受体细胞,人体胚胎干细胞（Stem cell）高度未分化的细胞，是受精卵分裂到囊胚时的细胞，具有体外培养无限增殖和多向分化的特性。几乎可以被诱导成所有的细胞类型。出于社会伦理的原因，一些国家禁止人类胚胎干细胞的研究。,转化,转化：重组DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。是一种自然现象,感受态,感受态：细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。细胞培养与收集CaCl2处理50100mmol/L CaCl2,10mmol/L Tris-HCl,PH8.0,冰水浴15min。,转 化,革兰氏阳性菌转化过程1.细菌感受态的形成。受体细
4、胞分泌激活蛋白，使细胞壁部分溶解，暴露细胞膜上的DNA结合蛋白。2.细胞膜上的DNA结合蛋白等因子激活核酸酶，降解DNA分子的一条链，将另一条链转入到受体菌内部。,转 化,革兰氏阳性菌转化过程3.单链DNA与其保护蛋白结合，转移到受体菌染色体DNA处。4.单链DNA同源重组到受体菌染色体5.转化子形成。,DNA转化感受态细胞,在感受态细胞中加入缓冲液和DNA，1小时以上，期间轻摇几次。迅速转移至42摄氏度水浴2min，促使感受态吸收DNA分子。转移到37摄氏度温浴5min，加入LB培养基筛选转化子,转化率及其影响因素,转化率1.转化子数/用于转化处理的DNA分子数2.转化子数/受体细胞数,转化
5、率及其影响因素,影响转化率的因素1.分子质量小，转化效率高大于30kb的重组质粒很难进行转化2.载体类型闭合双螺旋DNA要比线性DNA转化率高对细胞亲和性强的载体转化率高3.重组DNA分子的浓度与纯度,转导,转导：病毒感染细胞并将外源DNA分子导入到受体细胞并稳定遗传的过程。具有感染能力的噬菌体颗粒重组DNA头部蛋白、尾部蛋白,转染,转染：将重组的 噬菌体DNA直接导入受体细胞的过程。效率很低辅助噬菌体对受体细胞预感染，提高转染率，但会给操作带来很多不方便实际操作中很少使用,电激穿孔,原理：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上形成可逆瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。电压增高和作用时间
6、延长，有助于提高转化率，但细胞存活率降低。,三亲本杂交,基于非结合型质粒的迁移作用而建立的一种转化方式。接合型质粒、非接合性质粒将接合质粒转移到含有重组质粒的供体细胞中，然后将供体细胞与受体细胞混合，促使转化。三亲本：受体菌、含重组质粒的供体菌、含有结合型质粒的辅助菌。,重组DNA分子导入酵母细胞,聚乙二醇（PEG）/乙酸锂乙酸锂可使酵母细胞产生短暂的感受性状态。PEG可以在高浓度乙酸锂环境中保护细胞膜，减少乙酸锂对细胞膜的过度损伤，同时促进质粒与细胞膜的结合。,重组DNA分子导入酵母细胞,用溶菌酶剥去酵母菌的细胞壁，形成原生质体。酵母细胞壁主要由D-葡聚糖和D-甘露聚糖两类多糖组成，含有少量的蛋白质、脂肪、矿物质,Thank You,
