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1、实验二 限制性核酸内切酶消化质粒DNA,一、实验目的,1.掌握限制性核酸内切酶消化质粒DNA的原理与方法。2.了解酶切反应条件。,二、实验原理,限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中某特定核苷酸序列，并在识别位点内或附近切割双链DNA的核酸内切酶。在一定条件下（如合适温度、盐浓度等），它能在特定的切割位点裂解DNA分子中的磷酸二酯键而将双链DNA分子断开。,类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段(如Sma:5-CCCGGG-3)；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端（3 突出和5 突出的单链末端）的DNA片段称粘性末端，如EcoR、Hind 切割识别序
2、列后产生两个互补的粘性末端。,二、实验原理,EcoR,Hind,质粒是细菌细胞内独立于染色体之外能自主复制的双链环状DNA分子。本实验用到的是pGEM-T Easy质粒。,二、实验原理,凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。质粒有3种构型：1、超螺旋的共价闭合环状质粒DNA；2、开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂；3、线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同,因此电泳后呈3条带。超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA和开环质粒DNA。,二、实验原
3、理,EcoR或Hind可以将pGEM-T Easy质粒DNA切开成为线性DNA。用未经酶切的pUC质粒DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以推测酶切是否成功。,_,+,二、实验原理,Marker 1 2,图片说明：1 未经酶切的质粒DNA2 经EcoR或Hind酶切后的线性DNA和目的DNA,3000bp,2000bp,1000bp,600bp,500bp,目的DNA,三、仪器与试剂,主要仪器：恒温水浴箱、离心机、电泳槽与电泳仪主要试剂：限制性核酸内切酶（EcoR、Hind）10酶切缓冲液 琼脂糖 上样缓冲液 0.5TBE缓冲液 质粒DNA,四、实验步骤,1.建立反应体系：0.5mL无菌的
4、EP管(总体积20L)2.37，水浴1h。3.低速短暂离心。4.加4L上样缓冲液于离心管中混匀，1%琼脂糖凝胶电泳（100V,40min）。(取12L点样),无菌双蒸水 12L 质粒 2L 10buffer酶切缓冲液 2L内切酶 EcoR 4L,轻轻混匀，低速短暂离心,质粒酶切电泳图,五、实验结果,六、注意事项,1、操作时注意：（1）分子生物学实验多为微量操作，注意吸样量的准确性。（2）要求在冰上操作，并充分混匀。（3）打开EP管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。（4）水浴时，将EP管盖严，以防水进入管内。,六、注意事项,2.内切酶的使用时注意：(1)不使其污染与浪费；(2)注意加样顺序；(
5、3)注意限制性内切酶体积不应大于反应总体积的1/10，避免星活性（产生星活性的原因：高甘油含量、酶量过大、低离子强度、高pH（8.0）、含有有机溶剂、非Mg2+的二价离子存在）。,六、注意事项,3.质粒DNA对结果的影响：作为内切酶底物，DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。这种抑制作用可通过下列方式克服：（1）增加酶作用单位数（10-20U/ug DNA）、（2）增大反应体积以稀释可能的抑制剂（3）延长反应时间,4、反应缓冲液的影响反应缓冲液主要由TrisHCl、NaCl、Mg2+组成，其中
6、Mg2+为内切酶辅基；TrisHCl维持反应体系pH值在之间；NaCl浓度不同形成种级别的离子强度：低盐（10mM NaCl)中盐（50mM NaCl）高盐（100mM NaCl）不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。,六、注意事项,5、酶切消化反应的温度：DNA消化反应的温度，是影响限制内切酶活性的一个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有各自的最适反应温度。多数限制内切酶的最适反应温度是37，少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于37。,六、注意事项,6、酶切消化反应的时间：反应时间根据酶的单位与DNA用量之比来定，原则是DNA:酶=-:。本实验1小时即可充分酶解。,六、注意事项,7、限制性内切酶反应的终止，通常有以下两种方法：（1）采用65条件下温浴20min，通过加热失活内切酶；（2）加终止反应液（如0.5 mol/L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10 mmol/L）螯合内切酶的辅助因子Mg2+使内切酶变性以终止反应.,六、注意事项,谢谢各位,
