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1、中国农业科学院-哈尔滨兽医研究所深圳2014年4月29日,鸡马立克氏病流行及防控,刘 长 军,鸡马立克氏病,1907发现-1961-病原-MDV、命名-中国-70年代主要感染鸡和火鸡淋巴细胞的溶细胞感染和T-细胞淋巴瘤最早出现在3-4周，高峰在12-30周年龄易感性-日龄越小易感性越高-1日龄雏鸡比10日龄以上雏鸡易感性高几百倍水平传播-羽毛囊上皮细胞-复制病毒-长期排毒-通过空气传播发病率-5%30%,Map of the evolution of MD incidence.Colors represent the current existence of MD outbreaks as f
2、ollowed:red=current MD outbreaks;yellow=no current MD outbreaks;grey=data not available.The existence of MD outbreaks during 1990s is indicated by vertical stripes,秘鲁,俄罗斯,尼日利亚,摩洛哥,葡萄牙,中国,鸡马立克氏病导致脏器肿瘤及神经肿瘤,马立克氏病引起免疫器官萎缩,胸腺,法氏囊,对照 vv vv+,Introduction,马立克氏病病原-MDV,MDV属于疱疹病毒科、马立克氏病病毒属。MDV粒子由核芯、核衣壳、被膜和囊膜组
3、成，在感染细胞内可见直径为85-160 nm的六边形裸露颗粒即核衣壳。偶尔也能见到150-160 nm的有囊膜的病毒粒子；基因组为双股线性DNA长度约为166-180Kb。,MDV分类,Introduction,MDV的复制,早期溶细胞感染潜伏感染第二次溶细胞感染肿瘤增生-产生成熟病毒粒子,早期溶细胞感染,MDV在羽毛囊上皮细胞中的复制,淋巴器官 神经组织、羽毛囊上皮 肿瘤,新特点,宿主范围扩大火鸡感染发病混合感染REV、ALV（鸡病毒重组-LTR的插入）；NDV；细菌；霉菌毒力增强突破不同MD疫苗的保护作用急性发病症状3-4周龄即开始出现肿瘤，8-9周龄时已很严重，并能在3周龄引起特别严重的
4、短暂麻痹，从而导致很高的死亡率 不同日龄鸡感染性Rosenberg等，注射和同居接触19、34 和49日龄的SPF鸡，出现临床发病和肿瘤病变,Introduction,MDV毒力进化,MDV毒力越来越强：m温和型、v强毒力型、vv 超强毒力型、vv+超超强毒力型,临床症状由主要是慢性多发性神经炎转变为多发性神经炎和内脏淋巴瘤、内脏淋巴瘤、神经症状、严重的脑水肿和急性死亡,国内MD发病情况-黑龙江病例（多发性肿瘤）,图1，2，3分别为牡丹江地区病料（瘤化的卵巢、肠系膜和脾脏）。图4，5分别为大庆地区病料（瘤化的卵巢和肿大的肝脏）,青脚黄鸡3/3MD+，1/3只AL+,270日龄，900只 海兰褐
5、，病死近100只，,吉林省病例（多发性肿瘤）图1为发病鸡，2和3为系膜瘤，4为肝脏瘤。,长春，8/11 MD+，5000只，至110日龄，死1000,辽宁省病例（混感）图1为肌肉瘤，2为瘤化的腺胃，3为瘤化的肝脏。,4万套，海兰褐蛋种鸡，110日龄发病，A亚群ALV 9/11 AGP-2/11，MD+，PCR-3/8MD+公鸡40%A亚群,江苏病例（乌鸡和麻鸡）肾脏肿,40和60日龄，10%,山东,110日龄，10000只，发病20-30%，9/10 MD+,腺胃肿瘤化为特征的病例,大连,沈阳,腺胃肿瘤化为特征的病例,哈尔滨,牡丹江,脾脏肿瘤,2011-2013年MDV流行病学检测,-我国MD
6、V呈经常性、普遍性散发状态,省 鸡场 病料 阳性鸡场 阳性病料 阳性率,MDV与REV、ALV和CAV的混合感染（2011-2013）,-混合感染是常见现象,MDV分离毒株特性,注：NA表示未知，“”表示未检测。,MDV流行毒株致病性多在vv（9）-vv+（4）符合强、弱毒的分子特征,177bp,10株MDV分离毒株对SPF鸡的致病性,MDV流行毒株对鸡具有高致病性,5株MDV分离毒株对免疫鸡（CVI988疫苗）的致病性,-MDV致病性增加；现有疫苗对某些毒株不能提高完全保护。,MDV与REV混感和分子重组,一个混感感染病例 2011年某鸡场商品蛋鸡，40日龄开始发病。症状-腺胃炎，腺胃肿；鸡
7、瘦小；有死亡；无明显肿瘤。送检鸡-52日龄。检测结果MDV+、REV+,电镜,负染,切片,MDV,REV,存在MDV和REV病毒粒子,-高发病率、高致死率、高肿瘤率；突破疫苗保护.,致病性,分离株攻毒-腺胃MDV肿瘤特征,肿瘤组织病理学观察,组织上以多形态的淋巴细胞增生浸润为基础，包括小型、中型和大型淋巴细胞。即，细胞的大小不一，形态各异。细胞核淡明，核仁大而明显。浸润范围广泛，取代原来的正常组织（腺胃）。腺胃的肿瘤细胞可见多数的异常核分裂像。同时可见肿瘤细胞的坏死（核浓缩）,CVI988-分离株组,-肿瘤的差异REV肿瘤特征,肿瘤细胞为成淋巴细胞。细胞大小均一，细胞核淡明，核仁1-数个。细胞
8、浆淡染，细胞界限不明显。未见核分裂像。肿瘤细胞呈占位性，呈局灶性浸润。肿瘤组织病灶通常呈圆形或类圆形。未见肿瘤细胞凋亡和坏死。,背景：反转录病毒REV在疱疹病毒MDV基因组中的插入,重组基础混合感染现象-商业鸡群-多致瘤病毒共感染共同的宿主-淋巴细胞和相同的微环境，MDV-感染B和T淋巴细胞，转化T；ALV引起骨髓细胞转化MDV和ALV都在成纤维细胞中复制，ALV胸腺，法氏囊中复制；REV，淋巴细胞或网状内皮细胞，成纤维细胞中复制反转录病毒为了自身复制，可以整合到任何双链DNA中（宿主、MDV、HVT、禽痘病毒）,细胞中相同的复制位置,REV在MDV基因组中的插入验证Hot-Spot PCR（
9、REV和MDV上下游交叉引物检测，病毒重组的验证）,MDV pBAC-C全基因组序列,IRs区插入的相对位置（MDV Md5）,LTR,MDV086（细胞质蛋白）,MDV085（预测蛋白）,MDV083（反义RNA蛋白）,MDV084（ICP4）,MDV087（MDV1 S2）,MDV088（ICP22）,MDV089（Us10）,IRs区,TRs区插入的相对位置（MDV Md5）,LTR,MDV097（MDV1 S2）,MDV096（gE）,MDV095（gI）,MDV098（细胞质蛋白）,MDV099（预测蛋白）,MDV101（反义RNA蛋白）,MDV100（ICP4）,TRs区,插入重组
10、的意义：反转录病毒是混乱宿主和疱疹病毒遗传物质的元件之一。这种重组可能改变MDV的组织趋向性、传播方式、致病性、疫苗保护性-MDV的进化？,MDV meq序列-88株，测定序列-63株（2006-2013）参考序列-25株（中国分离毒株-11株，国外毒株-14株）我们测的63株中除了3株位于弱毒分支外，其他的60株位于一个独立进化分支（不同于国外的毒株）。,MDV meq,我国MDV流行毒株处于一个独立的进化分支,A：MDV毒株的长重复区遗传进化树,B：MDV毒株的短重复区遗传进化树,15株MDV（全基因组）分子进化,MD的防控,防止雏鸡MDV野毒早期感染控制混感-重组、加重MD？免疫特点-非
11、清除性抗肿瘤免疫、占位干扰作用-超感染和超感染抑制？-控制传播疫苗-毒株？-感染程度？免疫剂量二次免疫,控制污染源-抗病力-免疫,MD疫苗株的应用,Four generations of MD Vaccines:致弱的血清1型毒株(1970)HVT(1970s)双价苗HVT+SB1(1983)CVI988(Rispens株)(1990s)，“814”株,我国MD疫苗使用情况,曾经使用的疫苗：HVT、CVI988、“814”、HVT+SB1、HVT+Z4、HVT+SB1+“814”、CVI988+HVT,当前主要使用的疫苗：种鸡、蛋鸡-CVI988、“814”、HVT、CVI988+HVT 肉鸡
12、-主要为HVTHVT-IBDV-VP2-“立克法”“威力克”,814弱毒疫苗种毒株的建立,策略：自然弱毒中筛选、建立-弱毒疫苗种毒株优点-安全性好、稳定性好和免疫效力好。黑龙江省牡丹江（白洛克和来航）-多年没有发生MD-毒株培育：K株-DEF、CES；-“814”S株-DEF、QEF-毒株血清型和致病性：血清1型，自然弱毒株,安全性：（1）接种鸡12个月-（2）回归易感鸡10代免疫原性：实验室免疫攻毒（J-1株）K株的KC25和45代（稳定性）-PI：88.9传代特点:1.KC50-非融合细胞-50-120代也很少见2.病毒粒子的数量较多-几乎每个细胞都有病毒粒子3.容易见到-有囊膜的完全病毒粒子母源抗体干扰-HVT、“814”免疫鸡群,MD疫苗“814”株-净化净化必要性-强细胞嗜性-禽源RNA病毒、支原体污染-免疫失败的主要原因之一-MDV 814病毒DNA拯救,“814”克隆株的免疫原性,总结：1.我国MD流行呈现散发状态，发病率阶段性增高。2.多种病原混感是疫苗免疫失败的一个重要原因。3.我国流行的MDV毒力向更高方向进化。4.进化分析表明，我国的MDV流行株已经发生明显变化，并且处于一个独立的进化分支。5.正确使用疫苗和控制病原污染是防控MD的主要方法。,谢谢大家！,
