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1、华中农业大学动物科技学院,实验一 哺乳动物白细胞分离,左 波、柴 进,了解哺乳动物白细胞分离原理 掌握兔及猪白细胞分离方法 明确畜禽血液细胞组成差异,一、实验目的,二、实验原理,真核基因组DNA存在于细胞核的染色质中,血液新鲜组织福尔马林浸泡标本石蜡标本冰冻组织毛发体腔液洗嗽液精液,1 常用于DNA提取的材料：,2 血液组成,红细胞,又称红血球或红血细胞，是血液中最多的一种血细胞。红细胞中含有血红蛋白，因而使血液呈红色。,人和哺乳动物的成熟红细胞无细胞核,白细胞,白细胞无色呈球形，有细胞核，体积比红细胞大,光镜下，根据白细胞胞质有无特殊颗粒，可将其分为有粒白细胞和无粒白细胞。有粒白细胞又根据颗
2、粒的嗜色性，分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。无粒白细胞有单核细胞和淋巴细胞两种,血小板,也称血栓细胞，是体内最小的血细胞，是由骨髓中成熟的巨核细胞裂解、胞质脱落而成，呈圆形、椭圆或不规则的形状，无细胞核。,但它并非只是细胞碎片，它有一定的结构，能进行新陈代谢。,血小板的功能主要是促进止血和加速凝血,血小板遇到粗糙的血管壁伤口，就被破坏并释放出促使血液凝固的凝血酶。这种酶的前身是凝血酶原，在Ca2+参与下，凝血酶原激活物可催化凝血酶原转化为具有活性的凝血酶。,在凝血酶、Ca2+和其它一些因子的作用下，经过一系列变化，可溶性的纤维蛋白原就变成了不溶性的丝状纤维蛋白。这种蛋白形成后，互相
3、交织成网，并把血细胞网罗在内，使原来的血液凝集成块。,3 抗凝,可通过以下几种途径来实现：,（1）往血液中加入适量的抗凝剂（如柠檬酸钠）将Ca2+夺去，使其成为失钙血，这样可以防止纤维蛋白原变成纤维蛋白，从而避免了血液凝固。,（2）用试管刷反复搅拌，取出血液中的纤维蛋白，这种血叫去纤维蛋白血。由于缺少了凝血必需物质（纤维蛋白），所以血液不再凝固。,（3）降低血液温度，使酶的活性降低。,（4）保护血小板，减少凝血酶的释放。,抗凝剂,（1）乙二胺四乙酸（EDTA）盐，EDTA有二钠、二钾和三钾盐。均可与钙离子形成螯合物，从而阻止血液凝固。,Na2C10H14O8N2+Ca2+CaC10H12O8N
4、2+2Na+2H+,适用于全血细胞分析及血细胞比容测定。,（2）柠檬酸钠（trisodium citrate），柠檬酸盐可与血中钙离子形成可溶性螯合物，从而阻止血液凝固,2Na3C6H5O7+2Ca2+2CaC6H5O7+6Na+,适用于红细胞沉降率和凝血功能测定。,（3）草酸钠（sodium oxalate），草酸盐可与血中钙离子生成草酸钙沉淀，从而阻止血液凝固。适用于一般普通生化检查,（4）肝素（heparin），肝素的阴离子活性基团与抗凝血酶III（AT-III）的阳离子基团结合，加速抗凝血酶-凝血酶复合体形成，灭活丝氨酸蛋白酶，从而阻止凝血酶形成，拮抗凝血酶和阻止血小板聚集。此外肝素还
5、有催化抑制凝血因子的作用。适用于血流变检查,从血管取少量血液加入适量抗凝剂,有形成分经自然沉降或离心沉淀后，血液可分出三层：上层为淡黄色的血浆，下层为红细胞，中间的薄层为白细胞和血小板,4 白细胞分离,5 细胞破碎,渗透冲击法（Osmotic Shock）,此法将一定体积的细胞液加到2倍体积的水中，细胞中溶质浓度高，水不断进入细胞，使细胞膨胀，最后导致破裂。,在血浆中无机盐形成的渗透压称为晶体渗透压由血浆蛋白形成的渗透压称为胶体渗透压血浆渗透压的总值为两者之和。,红细胞在此溶液中大小、形状不变，故称为生理盐水,原理,0.9%氯化钠溶液的渗透压与血浆渗透压相等,血液中去除血细胞后余下部分就是血浆
6、。,将正常红细胞悬浮于不同浓度的NaCl溶液中即可看到：在等渗溶液中的红细胞保持正常大小和双凹圆碟形；在渗透压递减的一系列溶液中，红细胞逐步胀大并双侧凸起，当体积增加30%时成为球形；体积增加45%60%则细胞膜损伤而发生溶血。,红细胞在低渗溶液中会胀大，破裂，发生溶血，故低渗溶液不能用作静脉输液。,高于或低于血浆渗透压的则相应地称为高渗或低渗溶液。,细胞破碎的难易决定于其类型，红血球细胞容易溶破，动物组织细胞只有当其组织被机械切碎或匀浆后才易溶破。植物细胞很难溶破，因为植物细胞中含有大量的木质成分。,三、主要仪器及试材,实验器材：一次性注射器，长针头，10ml离心管，记号笔，酒精棉球，离心机
7、，一次性手套等,试 剂：蒸馏水，抗凝剂（0.5M EDTA溶液、或肝素）等。,四、实验方法与步骤,采血5ml左右，EDTA抗凝,3000rpm离心15min，弃上层血浆,加入2倍体积双蒸水，摇匀沉淀，静置10-15min，破碎红细胞,3000rpm离心15min，轻轻弃去上层，留白细胞沉淀（视红细胞破碎程度，决定是否重复此步骤1次）,五、实验注意事项,（2）采血后，应立即（或提前）加入1/10血样体积的0.5M EDTA抗凝剂，充分混匀，低温保存或立即送实验室分离白细胞；,（1）防止污染血液及被血液所带的病菌等感染,（3）分离白细胞时，离心速度不宜过大。,六、实验结果处理,提交“哺乳动物白细胞分离”实验报告（统一格式纸张）实验目的 实验原理 实验器材 实验方法与步骤 实验结果与分析 思考题,七、思考题,（1）畜禽血液有核细胞构成的差别；,（2）EDTA抗凝机制；,（3）渗透冲击法破碎细胞原理。,
