《人体显微形态学技术综合内容.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人体显微形态学技术综合内容.ppt（23页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、动物取材与固定,一、动物取材,（一）动物处死要求：动作迅速，及时解剖、取材与固定,（二）动物处死的方法：可采用麻醉法、空气栓塞法、颈椎脱臼或断头、动脉放血等。1、狗用麻醉法或击头法2、猫用窒息法3、兔用栓塞法4、小白鼠用断颈法,（三）动物取材选择 根据实验要求首先选择动物种类，其次选择组织部位及取材的大小，取材时应熟悉组织器官的结构特点。1、动物选择2、部位选择3、切面方向选择,（四）取材要求1、新鲜2、小而薄 1.5cm1.5cm 0.5cm 3、保持原有的形态4、注意环境温度的影响5、刀、剪要锋利,二、动物组织固定,（一）固定的目的和意义：防止离体组织、细胞自溶与腐败，保持组织、细胞与生活
2、时相似的形态和结构；使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变成不溶性物质，使其保持原有的结构；使组织中的各种物质沉淀、凝固后产生不同的折射率，形成光学上的差异，以便染色后易于观察和鉴别；固定剂有硬化作用，可增加组织硬度，便于制片；保存抗原及DNA、RNA，特别是准备用于做免疫组化染色和核酸原位杂交的标本，及时而恰当的固定尤其重要。,（二）动物组织取材与固定,1、成年家兔栓塞法处死 取下列组织心肌（心脏乳头肌）入ADF液中固定24h骨骼肌（舌肌）入中性甲醛的固定液液中固定24h神经节（颈胸椎处）入高尔基体固定液中固定18h脊髓（颈胸椎处）入2%的硝酸银水溶液中固定每班两只 两组同学完成。,2
3、、成年猫窒息法处死 取下列组织神经节（颈胸椎处）入高尔基体固定液中固定脊髓（颈胸椎处）入2%的硝酸银水溶液中固定卵巢 入中性甲醛固定液中固定膈肌入中性甲醛固定液中固定 每班壹只 两组同学完成,3、一月龄家兔栓塞法处死 取肋间肌，剪成0.2cm0.2cm见方的肌肉颗粒（共剪100颗）。取剪好的肌肉组织入蚁酸溶液中固定15min左右，呈半透明状即可。不经水洗，直接放入1%的氯化金水溶液中浸染15-60min左右，肉眼观察见肌肉组织呈金黄色即可，如已成棕色表明浸染过度，所以应随时观察。将已经还原好的肌肉组织用蒸馏水涤数次，放在滤纸上将组织上的水分沾干，再转入甘油酒精（甘油一份，50%酒精一份）中保存
4、备用。,4、小白鼠 断颈法处死 取小肠，用生理盐水将肠道内清洗干净，剪成2cm长的小段，入Regaud固定液中固定,线粒体切片标本的制作,1、取材：小白鼠小肠或肝2、固定：入Regaud固定液固定2天（每天需更换一次固定液）3、媒染：入3%重铬酸钾水溶液中媒染7天（每两天更换一次新液）4、冲洗：先用自来水冲洗24小时，然后用蒸馏水浸洗数次。,5、脱水透明：在酒精中从低浓度到高浓度依次脱水，100%以下的浓度每次1小时，在100%酒精中2次，每次30分钟，转入二甲苯2次透明，每次30分钟。6、浸蜡包埋：等量二甲苯与软蜡1次，软蜡1次，硬蜡1次，每次30分钟，用纸盒或金属包埋盒包埋。（包埋时注意切
5、面方向）,7、切片贴片烤片：载玻片上涂少许蛋白甘油，切片厚度2-4微米，在贴片容器中贴片，入37。C恒温箱中烘烤24小时。8、脱蜡入水：二甲苯2次，每次10min,100%酒精中2次,每次5min,100%以下的浓度每次2min，下行至蒸馏水。9、媒染：入5%铁明矾水溶液中媒染24小时（37。C恒温箱中）。10、染色：蒸馏水速洗后入苏木精染液中染色24小时。,11、分色：蒸馏水速洗后入2.5%铁明矾水溶液中分色，数秒后，显微镜下镜检，见细胞核和线粒体呈黑色，细胞质呈无色或灰色即可。此步骤非常关键，一定要不间断镜检。12、返蓝：自来水浸泡数小时13、脱水透明：与第8步骤（脱蜡入水）相反方向操作即
6、可。14、镜检封固：镜下检查，染色合格的切片滴1滴中性树胶，盖上盖玻片。放入凉片盒中。,高尔基体切片标本的制作,1、取材：猫或兔的神经节2、固定：入高尔基体固定液固定8-18小时3、冲洗：用蒸馏水速洗2次。4、镀银：入2%硝酸银水溶液中镀银48小时（室温下、避光）5、冲洗：用蒸馏水速洗2次6、还原：入硝酸银还原液中24小时,7、冲洗：用蒸馏水速洗2次8、脱水透明：在酒精中从低浓度到高浓度依次脱水，100%以下的浓度每次40分钟，在100%酒精中2次，每次20分钟，转入二甲苯2次透明，每次20分钟。9、浸蜡包埋：等量二甲苯与软蜡1次，软蜡1次，硬蜡1次，每次20分钟，用纸盒或金属包埋盒包埋。,1
7、0、切片贴片烤片：载玻片上涂少许蛋白甘油，切片厚度3-6微米，在贴片容器中贴片，入37。C恒温箱中烘烤24小时11、脱蜡入水：二甲苯2次，每次10min,100%酒精中2次,每次5min,100%以下的浓度每次2min，下行至蒸馏水。12、调色：入1%氯化金水溶液中2小时,常规组织切片制作（HE染色）,组织切片的染色方法很多，最常用的是HE染色法，该方法适用于人体或动物多种组织，对任何液体固定的组织和各种包埋的切片均可使用，所以，HE染色法显微制片技术的基本方法。,1、取材：动物多种组织（如：大动脉、大静脉、腹腔AV伴行处、疏松结缔组织、膀胱、鼻腔上皮组织、胃、睾丸、输精管、体皮、脑垂体、大脑
8、皮质、卵巢 等）2、固定：入中性甲醛固定液中固定24小时3、冲洗：自来水冲洗时间24小时。4、脱水透明：在酒精中从低浓度到高浓度依次脱水，100%以下的浓度每次2小时，在100%酒精中2次，每次1.5小时，转入二甲苯2次透明，每次1.5小时。,5、浸蜡包埋：等量二甲苯与软蜡1次，软蜡2次，硬蜡2次，以上各级每次1-1.5小时，用纸盒或金属包埋盒包埋。6、切片贴片烤片：载玻片上涂少许蛋白甘油，切片厚度6-8微米，在贴片容器中贴片，入37。C恒温箱中烘烤24小时。,7、脱蜡入水：二甲苯2次，每次10min,100%酒精中2次,每次5min,100%以下的浓度每次2min，下行至蒸馏水。以下程序按教
9、材材要求进行。注意事项：在0.5%的盐酸酒精中分色过程中，数秒后，必须要在显微镜下镜检，见细胞核呈蓝色，细胞质呈无色或灰色即可。此步骤非常关键，一定要不间断镜检。,神经元纤维切片的制作,1、取材：猫或兔的脊髓2、固定：入2%硝酸银水溶液固定3-6d，避光,35。C恒温箱中。3、冲洗：用蒸馏水速洗2次。4、还原：室温入硝酸银还原液24小时。5、冲洗：用蒸馏水速洗2次6、脱水：入100%酒精脱水24小时,7、浸蜡包埋：等量二甲苯与软蜡1次，软蜡2次，硬蜡2次，以上各级每次1-1.5小时，用纸盒或金属包埋盒包埋8、切片贴片烤片：载玻片上涂少许蛋白甘油，切片厚度6-8微米，在贴片容器中贴片，入37。C恒温箱中烘烤24小时。9、脱蜡镜检：二甲苯中脱蜡，镜检封片。,
