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1、,1,第8章 蛋白多肽类药物的 药物代谢动力学,2,蛋白多肽类药物的药代动力学十分复杂，这类药物是生物大分子,与传统的化学合成药物小分子在理化性质和体内过程等方面均有显著不同，其药动学特点和规律亟待阐明。该类药物的动力学研究不仅要解决相关理论问题，而且要求发展和应用新技术、新方法和建立新体系。,3,第1节 蛋白多肽类药物的体内过程,蛋白多肽类药物的体内过程相当复杂。化学结构特殊，其生理活性和体内过程不仅与其一级结构，而且与其二级和三级结构有关，作用强，用药剂量小，生物体内存在大量相似物质的干扰，在体内经受广泛的蛋白降解作用以及血液中存在多种不同类型的结合蛋白，如抗体、受体、受体拮抗剂等,4,一
2、、蛋白多肽类药物的吸收和生物利用度,蛋白多肽类药物的吸收呈现明显的给药途径依赖性。(一)口服吸收 多种屏障作用导致口服生物利用度很低，以致绝大多数蛋白多肽类药物口服后不能产生足够的有效血药浓度。这些屏障包括：吸收屏障 分子量大 极性较强 具有较低的分配系数和扩散性能 使其不易为亲脂性生物膜摄取，故很难通过胃肠道吸收。酸屏障 该类药物对胃液的强酸性（pH12）敏感，易被胃酸分解破坏。,5,酶屏障 胃肠道存在大量的酶，如胰丝氨酸蛋白酶中的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及弹性蛋白酶以及胃液中的胃蛋白酶都对蛋白分子产生消化降解作用。多数蛋白多肽类药物口服生物利用度很差，通常仅为23%，从而绝大多数这类药物不能
3、采用口服途径给药。仅极少数肽类可供口服给药，如环孢素，由于其独特的分子结构（环状十一肽）使其成为高度脂溶性并对酶相对稳定，通常制成油溶液供口服用，即使如此，其口服生物利用度亦差，且高度可变（从2%至92%），多种生理因素可影响其胃肠吸收。已知，肽类化合物中二肽和三肽尚可借助于主动机制通过肠黏膜吸收，但这种转运方式显示有明显的立体选择性，含D-型氨基酸的肽类通常吸收差，如氨基末端的氮原子或肽键甲基化或羧基末端转变为酰胺结构，则吸收进一步减少。,6,(二)皮下注射,该类药物皮下注射给药可避免体循环前的首关效应，吸收明显好于口服给药，但由于蛋白酶的普遍存在，这类药物也可部分受到皮下注射组织存在的蛋白
4、酶的代谢破坏，致其生物利用度亦不理想如重组细胞因子皮下注射通常生物利用度低于70%。,7,(三)鼻腔给药,鼻吸收远大于口服途径：鼻黏膜上皮存在众多微绒毛而具有较大的表面积 鼻黏膜具有广泛的血管网而成为亲脂性和亲水性药物的较好的吸收部位，同时给予吸收促进剂可使肽类药物鼻吸收远大于口服途径。这些肽类包括 黄体激素-释放激素（LH-RH），丙氨酸-赖氨酸-促肾上腺皮质激素（Ala1-Lys17-ACTH），胆囊收缩素八肽，-硫代苯基青霉素以及头孢菌素类等，胰岛素在大鼠的鼻吸收达30%，且吸收迅速，由于这一点，鼻吸收途径引起了人们的很大兴趣。,8,避免了肝脏的首关效应，拟首关效应（pseudo-fir
5、st pass effect）。鼻上皮的嗅觉区内的细胞色素P450活性甚至高于肝脏，主要由于NADPH-细胞色素P450还原酶含量较高（约高34倍），已发现在鼻黏膜中也存在肝脏中的三类可诱导的细胞色素P450同工酶，在鼻上皮中也发现第相结合反应活性。鼻腔给予的多肽类药物的生物利用度与其分子量显著相关3，对于分子量小于10kDa的分子不需加入生物黏附剂和促进剂，常可产生足够量的药物进入体循环，生物利用度在110%左右。较大分子，例如干扰素，人生长激素等即使使用生物黏附性给药系统，其较大的分子亦阻碍药物的有效吸收。肽类药物的吸收能够通过应用酶抑制剂而改善，某些表面活性剂如胆盐可使蛋白变性而抑制蛋白
6、水解酶，从而增加蛋白多肽药物的吸收。在鼻黏膜中主要的酶类有 氨基肽酶、肽链端解酶肽链内切酶。,9,氨基肽酶酶抑制剂:阿吗他定（amastatin）贝他定（bestatin）如鼻内单独给予lmg/kg人生长激素（rGH）溶液后的平均血药浓度显著低于rGH与以下2种氨基肽酶抑制剂的联合：0.015%阿吗他定（amastatin）以及0.015%贝他定（bestatin）。表面活性剂:羟乙酸钠（sodium glycolate）与促肾上腺皮质激素-释放激素（CRH）同用可使后者的鼻内给药生物利用度达100%。但表面活性剂的促渗效果因不同药物而异，如同样的羟乙酸钠对生长激素释放激素GHRH的促渗作用较
7、弱，鼻内给予（GHRH）的生物利用度仅为7.1%。,10,鼻腔途径目前已成为肽类药物静脉外给药的颇受重视的重要给药途径，不少这类药物已制成喷鼻剂或滴鼻剂用于临床实践。最早被采用的肽类药物为垂体激素，如催产素、加压素及其类似物，其中去氨加压素 由于鼻腔吸收良好，不良反应少，已成为尿崩症治疗的首选给药方法。醋酸布舍瑞林(LH-RH类似物)已有鼻内喷雾剂商品，其鼻腔给药是仅次于注射的有效给药方式。胰岛素 鼻用制剂已在美国有商品出售。,11,表8-1 某些蛋白多肽类药物鼻腔给药的吸收,*相对于静脉、肌肉和皮下给药,12,(四)透皮吸收,透皮吸收已成为令人注目的给药途径，可避免肠道和肝脏对药物的首关效应
8、，并可提供较好的传输控制和维持药物治疗水平于较长时间。通常认为皮肤的蛋白水解酶活性较低.,13,影响蛋白多肽类药物透皮吸收因素主要来自吸收屏障:,较大的分子量 荷电性使这类药物很难通过被动转运吸收，为克服这种屏障作用，通常采用离子电渗疗法，如LH-RH（一种十肽）分子量1182D，在pH6.0时荷正电，可用这种方法通过皮肤吸收。增强肽类药物的透皮吸收:透皮吸收促进剂、pH调节 蛋白水解酶抑制剂。,14,(五)其他途径,阴道内和肺内给予LH-RH类似物吸收程度达4095%，胰岛素达57%。直肠给予四胃泌素（Tetragastrin）生物利用度达16%，胰岛素达28%。,15,二、蛋白多肽类药物的
9、体内代谢,影响这类药物体内命运的一个最重大因素是它们给药后在体内经受广泛的酶介导的代谢分解，通常导致生物活性的丧失。(1)肝脏、肠道以及其他器官组织均存在大量代谢蛋白多肽的酶，就其反应类型可涉及第I相和第II相代谢反应。(2)静脉注射给药时这类药物的代谢失活主要发生在肝脏，当口服给药时则主要发生在肠道，造成显著的肠道体循环前消除。(3)细胞色素P450与蛋白多肽类药物的代谢关系密切，如环孢素（环状十一肽）的代谢是细胞色素P450 3A4介导的，其生物转化包括其分子上不同部位的单羟基化和双羟基化以及N-脱甲基反应。(4)酶抑制剂红霉素、维拉帕米、尼卡地平、酮康唑及依曲康唑可使环孢素血浓度升高，而
10、酶诱导剂如利福平、苯妥英以及苯巴比妥能够降低环孢素的血药浓度。,16,(一)肝脏对蛋白多肽类药物的代谢,肝脏对链长小于8个氨基酸的小肽具有高度的摄取 这种摄取呈现结构特异性 被摄取的多肽可以完整形式或代谢物形式排入胆汁中肝脏对多肽的摄取机制涉及以下两个过程：被动转运:疏水性肽类 主动转运过程:低疏水性肽类；内吞 载体介导多数水溶性的不能通过特异机制清除的肽类被认为是通过内吞作用进入肝细胞。受体介导的内吞继以溶酶体的分解作用适用于解释多种药物的肝脏代谢机制这些药物有神经生长因子，绒毛膜促性腺激素、催乳素、促甲状腺释放激素、TGF、上皮生长因子等。,17,（二）胃肠道对蛋白多肽类药物的代谢,胃肠道
11、内存在大量代谢蛋白多肽的酶，可分为以下三种类型。胃肠道腔内酶 这类酶参与蛋白质的消化，包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、-糜蛋白酶、弹性酶以及羧基肽酶A和B。这些酶类分别特异水解疏水性、碱性、大分子疏水性、小分子脂族及芳香族和碱性C-末端氨基酸，上述酶类的典型底物分别为：Z-His-Phe-Phe-oMe，苯甲酰基精氨酸甲酯（BAEE）、苯甲酰基酪氨酸乙酯（BTEE）、Ala-Ala-Ala甲酯、马尿酸-苯丙氨酸，马尿酸-精氨酸。,18,2.黏膜细胞酶,主要指与刷状缘膜结合的酶类。刷状缘膜构成了肠道上皮细胞的腔面，富含有多种酶和转运蛋白，参与各种蛋白类在细胞表面的代谢转化和吸收。这些酶类依其作用方式分为
12、4种类型，即氨基肽酶、羧基肽酶、二肽酶及肽链内切酶。前三种酶属于肽链端解酶，它们从肽类分子的氨基末端或羧基末端顺序水解肽类，氨基肽酶是肠刷状缘膜中最丰富的酶。尽管某些刷状缘酶是种属及底物依赖性的，但总的说来，其对肽类的药物水解速率遵循下列顺序：二肽三肽大分子肽。,19,3.刷状缘胞液酶,这类酶包括氨基三肽酶、脯氨酸肽酶、脯氨酰肽酶、二肽酶及肌肽酶，其典型的底物分别为：中性二肽、N末端为脯氨酸的三肽、C-末端为脯氨酸/马尿酸的亚胺二肽、N-末端为脯氨酸/马尿酸的亚胺二肽、肌肽（-丙氨酰组氨酸）。胞液酶优先水解二肽，对二肽的水解能力超过对三肽和大分子肽。,20,(二)肾脏对蛋白多肽的代谢,肾脏是最
13、重要的蛋白分解代谢的器官之一，特别是分子量低于60kDa的蛋白。通常，血循环中的肽类和蛋白能够自由地通过肾小球滤过，肽类可在刷状缘膜水解，其水解产物，游离氨基酸及短链多肽通常不经溶酶体的分解而通过近曲小管进入血液，当这些多肽分子量接近35kD或更大时，则往往在近曲小管的刷状缘膜被内吞（而不是水解）并随后被溶酶体消化，生成的游离氨基酸和短链多肽返回血液循环中。,21,(三)其他器官组织对蛋白多肽的代谢,由于蛋白水解酶的普遍存在性，蛋白多肽药物在体内的代谢部位极其广泛。在肝、肾和肠道以外的组织也都存在各种水解蛋白多肽的酶，即使在一般认为蛋白水解酶活性较低的皮肤，也发现降解肽类的酶屏障，皮肤中的酶代
14、谢活性主要在表皮，在培育的小鼠角质细胞和小鼠表皮的匀浆中测得了氨基肽酶的亚细胞分布。,22,三、蛋白多肽类的化学结构和化学修饰对其体内过程的影响,（一）糖蛋白分子中糖基的作用 近年，大量细胞因子被开发，它们在化学结构上属于糖蛋白。糖基在糖蛋白的体内血浆时程的调节中起着重要的作用。典型的药物为 红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）为含唾液酸的糖蛋白激素，分子中约40%为糖类，包括一个O-联结和三个N-联结的寡糖。该激素的糖基在体内外活性表达中十分重要，业已表明，这些糖基是EPO体内活性所必需。不含唾液酸的EPO在体内无活性，这种活性的丧失可通过脱唾液酸EPO从血循环的快速清除加以
15、解释。该蛋白脱去唾液酸后暴露出半乳糖残基，后者能为肝细胞表面存在的半乳糖受体识别，从而促进了EPO被肝细胞半乳糖结合受体的结合和内吞，继被溶酶体消化。,23,在大鼠肝灌流系统，脱唾液酸的天然和重组人EPO的血浆消除比完整的EPO快，原形EPO的分布半衰期和清除半衰期分别为53分钟和180分钟，而脱唾液酸EPO的消除半衰期仅为2分钟。大鼠静脉滴注125I标记的rhEPO后其消除缓慢，血浆半衰期约为2小时，而脱唾液酸EPO则在10分钟内迅速自血循环中清除，给药后30分钟85%的注射剂量在肝内被回收。近年许多重组细胞因子被研制，它们多数在血循环中不稳定或引起不良反应，但EPO的临床治疗获得较大成功，
16、一方面由于EPO指向于特定的成红细胞，另一方面则由于其体内较稳定。这种稳定性主要取决于分子中高比例的糖类的存在，从而逃脱肝细胞的摄取。,24,（二）氨基酸残基对寡肽的肝清除的影响,肽类分子中氨基酸残基对肽类的肝清除速率有显著影响。随着丙氨酸数目的每一增加即伴有肽消失速率的显著增加；相反，随着甘氨酸残基数目的每一增加，肽的消失速率显著减少。,25,（三）蛋白多肽一级结构的PEST假设,Roger等通过文献资料的总结发现，那些在真核细胞内快速分解的蛋白质分子结构通常含有共同的氨基酸序列，此即所谓PEST假设。该假设认为细胞内半衰期短于2小时的蛋白质的氨基酸序列具有一个或一个以上富含脯氨酸（P）、谷
17、氨酸（E）、丝氨酸（S）和苏氨酸（T）的区域9。这些富含PEST的区域的两侧通常（但不总是）有数个带正电荷的氨基酸组。所有的PEST区域的共同点是局部高度集中的P、E、S或T，而天冬氨酸较少。PEST序列能够赋予蛋白多肽的快速分解 确切机制尚未明确,然而，人们发现短寿的蛋白质的分解需要的Arrhenius激活能（Ea）仅为1015kcal/mol，长寿蛋白的分解所需的Ea接近30 kcal/mol。这种不同提示存在2种分解通路，各具不同的速率限定性步骤。PEST区给予蛋白一种快速降解的易感性，从而更易发生胞内蛋白水解。,26,（四）体内蛋白的化学修饰,1.体内蛋白化学修饰的含义 少许的化学修饰
18、是导致蛋白水解的首要过程。体内蛋白的化学修饰促进了蛋白的水解，即经修饰的蛋白的降解速率大于相应的未修饰的即天然的蛋白质,27,已知至少有9种这样的化学修饰，又称“标示步骤”（marking step），能够易化蛋白的水解，这些包括：丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化，半胱氨酸残基的混合二硫化物衍生物的形成 赖氨酸残基氨甲酰化、非血红素铁硫中心的氧化、赖氨酸的-氨基与泛素的结合 甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亚砜和甲硫氨酸砜、谷氨酰胺和天冬酰胺残基的脱酰胺基 糖基化 细胞色素P450酶系统对氨基酸的氧化。在以上化学修饰中引人注目的是细胞色素P450酶系统,28,2.化学修饰加速蛋白水解的机制,影响这种伸展型与折
19、叠型之间的平衡的众多因素可影响蛋白降解的速率。化学修饰可使这种平衡移向伸展型，从而使伸展型浓度较高。天然的蛋白往往以折叠型存在，从而处于一种局部的最低能量构象，在天然状态和伸展状态之间能量相差515Kcal/mol，从而使得这两种状态的相互转化十分快速。研究表明，在决定蛋白水解的易感性中，折叠型和伸展型之间的平衡可能较天然蛋白构象本身还更为重要，故整个降解速率受平衡时伸展型浓度的控制。蛋白起初的水解性裂解是蛋白降解速率的决定性因素，且裂解最可能发生在蛋白瞬间处于伸展或部分伸展状态的那一时刻，存在的非天然蛋白量的增加可能导致降解的增加。,29,3.蛋白氧化与蛋白多肽药物代谢之间的关系,MFO催化
20、的蛋白氧化是蛋白降解的一个信号，蛋白的更新将受那些能够影响MFO活性的因素的影响，因而，某些食物以及药物的摄入能够影响蛋白的降解，能够诱导P450系统药物，如巴比妥类就可能导致蛋白降解增加，有报道将环己苯巴比妥加至重建的P450系统，则谷氨酰胺合成酶的氧化失活增加3倍。,30,第2节 蛋白多肽类药物的药物代谢动力学特点及其影响因素,一、蛋白多肽类药物的代谢动力学特点（一）显著的首关效应 和小分子合成药物相比，蛋白多肽类药物口服具有十分明显的首关效应，由于这类药物在胃酸中的不稳定性及胃肠道和肝脏中普遍存在的蛋白水解酶，使这类药物在到达体循环前大量降解而致生物利用度极低，故绝大部分蛋白多肽类采用胃
21、肠外给药途径，特别是静脉注射给药,31,（二）消除半衰期短,由于这类药物体内迅速降解，导致原形药物的体内存留时间甚短，通常半衰期仅为数分钟或0.51.0小时左右，如胰岛素在人体半衰期不到9分钟，静脉注射后1小时几乎所有胰岛素被清除，组织型纤溶酶原激活物（t-PA）半衰期为26-55分钟，水蛭素（hirudin）为60-100分钟。这种短半衰期迫使它们在临床应用时不得不采用静脉滴注或多次频繁给药，以维持恒定的有效血药水平。,32,（三）表观分布容积通常较小,这类药物通常水溶性较强，亲脂性较差，不易透过细胞膜和生理屏障，故多数药物的表观分布容积相当于细胞外液体积。如水蛭素在人体的表观分布容积约为0
22、.28L/kg，相当于细胞外液体积。这类药物在血液中的浓度往往较高，而在脑组织中的浓度较低。,33,（四）非线性动力学性质,蛋白多肽类药物的吸收、结合和消除均可能涉及非线性饱和动力学。125I-rh TNF Da小鼠iv 25、67.5和152 g.kg-1的125I-rh TNF Da后曲线下面积分别为41、180 和526g.L-1.h-1，清除率分别为0.66、0.41和0.31L/hkg，说明随剂量增加，125I-rhTNFDa显示非线性药动学。rh-sc-uPA猕猴静脉注射重组单链尿激酶型纤溶酶原激活剂（rh-sc-uPA）后t1/2和MRT随剂量增加而延长，药-时曲线下面积明显大于
23、剂量的增加，全身清除率（CLs）随剂量增加而减慢，提示研究剂量范围内可能涉及多个酶反应，为剂量依赖性非线性动力学过程。,34,又如肝细胞增殖因子（HGF）用酶联免疫法检测其血浆中浓度变化时发现，HGF的特异性清除和非特异性清除均显示非线性。iv低剂量（13gkg-1）HGF后，分析其血浆清除率的变化时发现，此时主要是HGF与其受体的结合发生饱和，即特异性清除发生饱和，iv高剂量（0.3-1mg/kg）时，不仅HGF与其受体的结合发生饱和，HGF与HSPGs的非特异性结合也发生了饱和。,35,二蛋白多肽类药物药动学的影响因素,（一）结合蛋白的影响 蛋白结合是众所周知的小分子外源性化学药物的非特异
24、性现象，但对蛋白多肽类药物而言，这一结合现象多为特异性蛋白引起的，受体 抗体结合成为一种生理作用，这些结合蛋白往往是生理学上具有活性的蛋白多肽类物质的转运者、激活物以及调节剂。它们可在细胞水平调节治疗性蛋白多肽药物的效能，可影响这类药物的体内过程和药动学行为，特别是可影响治疗性蛋白多肽的体内清除并干扰其体液分析。在某些情况下，结合蛋白作为一种储存库使其体内存留时间延长，相反，结合蛋白也可成为其清除机制而加速这类药物自机体的清除。,36,（二）种属特异性,和小分子化合物不同，蛋白多肽具有结构和活性种属特异性，特别是氨基酸序列，对于相同的实体在不同种属之间有所不同，这就有可能使得一种活性蛋白在不同
25、种属试验时变得无活性，且成为一种异物而导致免疫原反应。例如，干扰素或红细胞生成素天然情况下是糖基化的，而其他一些如生长激素和胰岛素则非糖基化。业已发现糖基化程度亦有种属特异性，加入糖基的缘由尚未充分了解，糖基能够保护蛋白免遭降解和抗原识别。除去糖基后蛋白的清除率既可改变，也可不发生改变，因而在开发一种糖基化蛋白时需要对此进行研究，因为哺乳动物蛋白的克隆大部分在细菌细胞中完成的，得到的是非糖基化产物。,37,（三）给药方案依赖性药物作用,蛋白治疗药物的给药方案可影响该类药物的药效动力学，特别是蛋白激素类，这些激素生理情况下的分泌具有生理节律性，外源性蛋白治疗药不同给药速率和方式可产生不同的作用。
26、,38,如生长激素释放激素（GRF）半衰期很短，仅为数分钟，按传统的药动学原理，GRF应连续或多次给药以维持恒定的血药浓度，但这与其作为生长促进剂的临床应用相矛盾。当连续或脉冲式静脉给药后，GRF变得无效，不能维持生长激素的释放，每天一次或两次单剂推注，则能刺激生长激素的释放。又如生长激素（GH），实验研究表明垂体切除的大鼠中，每日一剂GH引起体重和骨骼生长速率的显著增加，相同剂量的GH以每日9次脉冲式给药使体重增加，骨骼生长速率增加27%以上，CH连续静脉给药导致生长速率的显著降低。促性腺激素释放激素 连续给药导致促性腺激素分泌抑制，脉冲式给药则能最有效的促进性腺激素的释放。黄体生成素释放激
27、素（LHRH）以生理脉冲频率（每90分钟一次）短期、小剂量给药时，对垂体性腺系统起促进作用，以非生理脉冲频率长期大剂量给药可以致垂体分泌黄体生长素（LH）和卵泡刺激素（FSH），引起性腺分泌激素能力下降和性器官萎缩。这种给药方案依赖性作用亦见于甲状旁腺激素、松弛素、组织型纤溶酶原激活物等。,39,（四）蛋白的免疫原性,可诱发机体产生抗体，抗体的存在能够失活（中和）蛋白药物的生物活性，影响蛋白药物的体内分布，代谢和排泄，甚至或可能引起继发性不良反应和疾病，从而使得临床前和临床研究的结果变得难以解释。抗体对蛋白药物的失活可通过封闭蛋白药物分子中的活性中心或通过对活性以外的更为远离的部位的结合改变蛋
28、白的三级结构，即立体效应而导致蛋白药物活性的丧失。抗体除可中和蛋白药物的生物活性外，还可通过影响其药代动力学而进一步影响蛋白的效能，这种影响表现为增加或减少抗原-抗体复合物的清除，如果生成的抗原-抗体复合物较未结合药物本身清除更快，则蛋白药物可因这种结合而失活，不论这种抗体是中和性的还是非中和性的。,40,（五）内源性干扰,内源性成分对外源性蛋白的药代动力学产生干扰，因而在阐明外源性给予的蛋白药物的确切药代动力学时，内源性物质的影响必须予以控制，如通过静脉滴注葡萄糖和生长激素抑制素以抑制胰岛素和生长激素的内源性释放，从而使得有可能对外源性胰岛素和生长激素的药代动力学作出确切解释。还要考虑的是外
29、源性给予的是药理剂量，而非生理剂量，药理剂量的蛋白质能改变蛋白质的体内过程，因机体会将药理剂量视为生成过度而作出调节反应。机体暴露于高浓度的蛋白药物可能导致不可预测的不良反应。这些均可影响蛋白多肽类药物的药动学。,41,（六）给药系统,1.缓释注射给药系统 埋植剂和微球注射剂两种，其中以微球注射剂最为引人注目。在诸多多肽缓释注射剂中研究得最为成功的品种为黄体生成素释放激素（LHRH）及其类似物曲普瑞林（triptorelin）、亮丙瑞林（leuprorelin）、布舍瑞林（baserelin）、高舍瑞林（goserelin）那法瑞林（nafarelin）LHRH在体内易被酶降解，半衰期极短，仅
30、3.5-5分钟，当用于抑制垂体-性腺系统功能时，需要每日给药，一个疗程36个月。上述缓释制剂均以聚乳酸-羟乙酸(PLGA)为骨架材料，制成缓释制剂，其半衰期分别延长至8、16、30、80和144分钟，丙氨瑞林（LHRH-A,alarelin）是天然LHRH的九肽拟似物，活性为LHRH的1520倍。为我国自行研制的类新药。该药为以PLGA为载体的长效微球，聚合物骨架能够保护微球内部药物不被降解，可缓释一个月。纳米粒给药系统 近年快速发展的纳米粒给药系统在蛋白多肽类药物的体内传输中有着极广阔的应用前景，可有效延长这类药物的体内释放，避免酶的降解，提高生物利用度。,42,2.口服给药系统,数十年来人
31、们一直致力于寻找适合于蛋白多肽类药物的非注射给药系统，其中主要是口服给药系统，其采用的策略主要是：加入蛋白酶抑制剂，吸收促进剂和稳定剂以克服口服吸收中遇到的屏障作用；肠溶包衣技术微囊、微球技术及微乳技术；部位特异性结肠给药技术；其他特殊技术，如人体红细胞载体，具受体介导吞饮机制的蛋白结合物等。胰岛素口服给药系统的研究在所有蛋白多肽类药物中最为突出。,43,3.其他非注射给药系统,在蛋白多肽的非注射给药系统中，鼻黏膜给药备受关注。胰岛素鼻腔给药生物利用度达10%30%，在美国已有商品出售。脑啡肽类似物和胰高血糖素生物利用度则高达70%90%。胰岛素制成气雾剂喷雾吸入在兔体内生物利用度达57%，直
32、肠给予四胃泌素（Tetragastrin）和胰岛素的生物利用度分别达16%和28。阴道黏膜给予LHRH类似物生物利用度达40%90。,44,4.蛋白多肽的化学修饰,改善蛋白多肽类药代动力学性质的一个主要手段是对这类药物分子进行化学修饰，主要将蛋白多肽与生物可降解的高分子可溶性载体（聚合物）结合形成蛋白质-聚合物共轭体，常用的载体（聚合物）为 右旋糖酐、白蛋白,45,聚乙二醇（PEG），以PEG应用最为广泛。PEG具有良好的水溶性，用适当方法活化后可与各类蛋白偶联，PEG无毒，良好的生物相容性，从而使其成为最广泛使用的蛋白化学修饰剂。PEG与蛋白多肽以共价键形成的轭合物的性质较未修饰的原蛋白多肽
33、很大改善，表现为 溶解度增高，分子量加大，稳定性增强，药物血循环中存留时间延长，生物半衰期延长，生物利用度提高，免疫原性和过敏反应降低甚至消失，而活性基本不变。,46,人工重组白细胞介素-2（rhIL-2）利用PEG5000修饰后，使其由疏水性变成亲水性，体内半衰期显著延长，在HIV感染患者可每周一次给药。腺苷脱氢酶（ADA）经PEG修饰后该酶可在血液中存留12周，抗原反应降低，而未修饰的ADA进入血液后数分钟内即被肝脏清除。r-水蛭素 消除半衰期仅为50100分钟，但制成的2：1的聚乙二醇重组水蛭素结合物（PEG-hirudin）单剂iv后T1/2a为13 h，T1/2 B延长至12小时，有
34、希望成为1日1次给药的长效抗凝抗栓药物。,47,组织型纤溶酶原激活物尿激酶链激酶葡激酶弹性蛋白酶蝮蛇抗栓酶超氧化物歧化酶L-天冬酰胺酶无基质牛血红蛋白牛血清白蛋白白细胞介素-2肿瘤坏死因子-抗肿瘤抗体-葡糖苷酸酶抗体等通过与PEG形成结合物后其药动学和药效学性质均大大改善。,48,5.前体药物的应用,将蛋白多肽药物制成抗酶前体药物以及亲脂性更强的前体药物，有利于抵抗蛋白酶的降解破坏以及增加亲脂性而提高生物利用度。,49,6.脂质体,作为药物载体的脂质体受到广泛重视，如IL-2，IFN，天门冬酰胺酶被包埋在脂质体内都表现出较长的半衰期，释放延缓，药效提高的特点，胰岛素与脂质体结合或混合后均有抗胃
35、蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶降解作用，脂质体不仅能保护被包埋的蛋白多肽药物，延长半衰期，还可提高其靶向性，并能促进蛋白多肽类药物的透皮吸收。,50,第3节 生物样品中蛋白多肽类药物的分析方法,和传统药物比较，蛋白多肽类药物的检测面临相当大的难度，其主要原因是：这类药物多为生理活性物质，化学结构特殊，稳定性差，体内处置十分复杂。生物体内存在大量干扰物质，如结构相同或相似的内源性蛋白多肽类物质，细胞因子、蛋白类治疗药物降解产物、体液基质、体内结合蛋白以及针对治疗药物的抗体等。故要求检测方法应高度特异。如何特异地将目标蛋白多肽分子与干扰物质区分是迄今为止尚未完全解决的一大难题。该类药物生理活性强，用药
36、剂量很小，通常为微克级水平，致体液中药物浓度极低，故要求检测方法必须具有极高的灵敏度。由于存在以上困难，致使通常采用的方法如HPLC、GC不适用。目前尚无一种完全满足蛋白多肽药代动力学研究要求的分析方法。,51,Challenge&Opportunity人用药物注册国际协调会议（ICH）对生物技术药物临床前安全性评价提出:“在科学基础上的灵活性和具体情节个别处理”的总则(case by case)。通常将几种方法联合使用，互为补充以获得较可靠的结果。随着现代科技的发展，已为蛋白多肽类药代动力学研究提供了多种分析手段。,52,一.生物检定法,定义：该法是利用在体和体外组织或细胞对被测活性蛋白多肽
37、类药物的某种特异反应，通过剂量（或浓度）-效应曲线对目标蛋白多肽进行定量测定的一种分析方法。,53,这类测定方法又分：离体组织（细胞）培养技术以细胞增殖、分化或细胞毒性为基础，以细胞数目的增减为量效指标。随着分子生物学的发展，许多依赖性细胞株被建立，从而增强了特异性和灵敏度。如rhIL6和rhTNFDa的药动学研究文献报导曾分别采用rhIL6依赖性细胞株7TD1和TNF敏感细胞株L929测定给药后血清药物浓度时间变化。非细胞培养方法（蛋白多肽的特异生物学反应）如水蛭素的药动学研究可利用其抗凝活性进行，如凝血酶时间测定法、生色底物法和蝰蛇毒测定法等；纤溶酶原激活物利用其溶栓作用采用纤维蛋白平板法
38、测定。离体组织进行分析如催产素采用离体子宫法；在体分析法，如胰岛素的小鼠血糖法等。,54,优点 是测定药物的生物活性，缺点缺乏特异性，不能定量失去活性的代谢产物，不能区分内源性和外源性细胞因子；灵敏度差，为起动生物过程，细胞因子的浓度必须在阈水平以上，低于阈水平的样品将不能被定量，从而降低了方法的灵敏度；耗时，为完成分析需时间较长，往往达数日或数周；不同实验室的结果有很大差异性，致不同单位之间的比较难以进行，这种差异性可能来自细胞传代的差异或细胞对某种生物学作用产生的获得抵抗性。,55,二、免疫测定法,定义：利用直接针对被分析蛋白质、多肽上的不同抗原决定簇部位的单克隆抗体或多克隆抗体特异地识别
39、被分析的目标蛋白质，再以放射计数、比色等方法予以定量。该法系将抗原抗体反应配以灵敏检测的方法。常用方法有以下三种（参见第18章）。,56,（一）放射免疫测定法(RIA),该法系将固定微量的标记抗原(多为125I-Ag)和待测抗原(药物)与已知限量的抗体(Ab)起竞争性结合反应，待测抗原含量与标记抗原-抗体复合物的放射强度成反比。这是将同位素测量的高度灵敏度和免疫学抗原-抗体结合反应的高度特异性相结合的一种超微量分析方法，方法的特异性取决于抗原的亲和力。,57,（二）免疫放射定量法(IRMA),为近年发展的新方法，和RIA相似之处是同为竞争性蛋白结合测定法，但不同的是IRMA将已知的特异性单克隆
40、抗体包被在固相载体上，形成固相抗体(Ab)，加入待测血清(含待测抗原Ag)，Ag与固相Ab结合形成Ag-Ab复合物，再加入过量的特异性125I标记单克隆抗体Ab，形成Ab-Ag-Ab夹心状复合物，故具有较高的特异性，且灵敏度亦较RIA高。,58,（三）酶联免疫吸附测定法(ELISA),该法的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保持其免疫性，又保留酶的活性。在ELISA法中，以双抗体夹心法测抗原应用最广泛，将已知的特异性抗体包被在固相载体上，形成固相抗体，加入含相应抗原Ag的待测标本，Ag与固相Ab结合成复合物，再加
41、入特异性酶标抗体，后者与已形成的Ag-Ab复合物结合，加入酶的相应底物，根据酶催化底物显示的颜色深浅对待测物进行定性和定量，(图8-1)。,59,60,目前ELISA法已成为一种“备选方法”而被广泛用于蛋白多肽类药物的药物动力学研究，这是由于该法具有以下优点：高度的灵敏度 由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫学反应的结果。如白介素-5，用双抗体夹心ELISA法的检测限低至7.8pg/ml，较应用鼠BCL1细胞的生物检定法灵敏10000倍。较高的特异性 由于应用抗原抗体反应故和生物检定法相比特异性较高。易于操作、快速、不使用同位素、无辐射源，适用于批处理。试剂使用寿命长。,61,免疫测定法存在
42、以下缺点：该法测定的是待测蛋白多肽的免疫活性而非生物活性。该法不能对蛋白多肽作出阳性鉴定，如确切的生化组成和序列。易受多方面因素的干扰：一种形式的干扰来自代谢产物，如果它们在原形药的免疫测定中具有交叉反应性，就能显著干扰生物利用度的测定。另一种干扰来自抗体的形成，这在临床前研究尤为突出，因为给予的人蛋白对动物明显是外源性的。这些抗体可能是中和性的或非中和性的，它们可影响蛋白多肽类药物的清除和药理作用，并对其定量测定产生影响。结合蛋白的存在也能够构成蛋白多肽类药物测定的严重的干扰，甚至可使直接的免疫学测定毫无价值。对于低亲和力结合蛋白的干扰可用稀释法加以克服，但样品的稀释可降低检测的灵敏度；稀释
43、法不能克服高亲和力结合蛋白的干扰，可能需要采用抽提的方法以排除这些干扰。基质效应免疫学测定还受基质特异的影响，生物体液以及缓冲液的不同往往能够改变蛋白的反应性，某些可通过向血清样品中加入免疫球蛋白予以处理，检测标准曲线必须用相关的生物体液加以建立。,62,三.同位素标记示踪法,该法系在目标蛋白多肽分子上标记同位素，从而鉴别目标蛋白多肽与内源性蛋白多肽。因同位素的放射性可起到示踪作用，故该法是最常使用的研究蛋白多肽体内处置的方法。,63,（一）蛋白多肽药物的同位素标记方法及其表征,该法需将目标蛋白多肽进行同位素标记，标记方法有外标法（化学联接法）：氯胺T或Iodogen法如蛋白中含有酪氨酸或赖氨
44、酸等适宜的氨基酸，可用外标法，即将标记物如125I通过化学方法偶联至完整蛋白中，内标法（掺入法）在外标法不可行时，可用内标法，即将标记以3H、14C或35S等同位素的氨基酸加入生长细胞或合成体系中，从而获得含同位素的蛋白多肽分子，但因其复杂而少用。,64,标记后的蛋白多肽在给药前必须充分予以表征，即必须测定其比放射性放射纯度被标记的蛋白多肽的生物活性。比放射性过高可引起蛋白质三级结构的改变和变性，从而影响其生物活性、免疫活性和体内过程，过低则影响灵敏度。放射性纯度必须高于95%，还必须表明标记的蛋白多肽与未标记的蛋白多肽具有相同的生物活性。,65,（二）同位素标记示踪法的优缺点,同位素法具有极
45、高的灵敏度，尤适于药物组织分布的研究，但亦存在很多缺点，最突出的问题是它不适于人体药代动力学的研究特异性差。众多资料表明，蛋白多肽在体内迅速降解，测定样品总放射性不能代表原形蛋白多肽的浓度，再者通过分解代谢释放出的标记氨基酸又可被机体重新利用，从而使得测得的结果可能代表了蛋白多肽的更新。,66,无论通过内标还是外标法标记的蛋白给予机体后，标记物在体内能够失去，例如125I标记的蛋白质在体内可发生脱卤素而释放出游离的放射活性碘，如碘标记的人生长激素（GH）给药后数分钟血浆中即出现游离碘，给药后60-90分钟，游离碘已占血浆中总放射活性的绝大部分。由上可知，应用总放射活性测定是不可取的，必须采用其
46、他手段对组织中放射性活性的性质进行进一步研究。,67,（三）同位素标记示踪法与其他分析手段的联合,1.同位素标记示踪法与SDS-PAGE电泳法相结合 SDS-PAGE技术是分离和定量分析蛋白质的常用方法，该法根据药物分子量的大小选择不同浓度的凝胶电泳，借助于控制电流等条件使原药与其他产物分离，然后通过切取相应凝胶条直接进行放射性计数或放射自显影方法检测电泳放射性图谱。该法设备简单，具有较高分辨率、灵敏度和特异性，不失为一种较好的方法。例如，近年国内报导神经生长因子（NGF）采用125I标记示踪法与SDS-PAGE电泳法结合的方法测得125I-NGF的t1/2为2.223h（iv），CL为0.3
47、21 Lh-1，Vd为1.259 LKg-1，MRT为3.592 h，与TCA沉淀法测定结果基本吻合，电泳法较客观地测定了原形多肽药物的浓度。,68,2.同位素标记示踪法和三氯醋酸（TCA）沉淀法相结合 TCA沉淀法根据蛋白质分子量的差别进行酸沉淀分离，由于大分子的蛋白质能为TCA沉淀而小分子量的多肽片段一般不被TCA沉淀，于是加入一定浓度的TCA可将含标记蛋白质的生物样品分为酸沉淀和酸可溶两部分，测定酸沉淀部分的放射性可较好地反映原形蛋白质多肽药物的含量。酸沉淀法方法简单，能够发现蛋白多肽药物生物降解的程度，已成为最常使用的辅助手段。,69,3.同位素标记示踪法与HPLC法结合 HPLC以其高度的特异性等特点而成为技术最为成熟、应用最为广泛的体液药物分析手段，与同位素标记示踪结合可增强后者的方法特异性。反相HPLC、排阻HPLC、离子交换HPLC分别根据保留时间与蛋白多肽的疏水-亲水性，分子量大小，解离程度等特征分离样品中待测物质，可同时测定原药和降解产物，其中排阻HPLC亦可得到有关结合物的信息，常采用梯度洗脱或阶梯洗脱从而获得较好的分离效果。,
