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1、,第六章分子生物学研究法（下）,content,一、基因表达研究技术,content,1995年Velculescu等提出了基因表达系列分析(Serial Analysis of Gene Expression,SAGE)技术，能同时对上千个转录物进行研究。,A.基因表达系列分析技术,content,SAGE的主要依据有两个。第一，一个910碱基的短核苷酸序列标签包含有足够的信息，能够唯一确认一种转录物。例如，一个9碱基顺序能够分辨262144个不同的转录物(49)，而人类基因组估计仅能编码80000种转录物，所以理论上每一个9碱基标签能够代表一种转录物的特征序列。第二，如果能将9碱基的标签集
2、中于一个克隆中进行测序，并将得到的短序列核苷酸顺序以连续的数据形式输入计算机中进行处理，就能对数以千计的mRNA转录物进行分析。,content,以biotinylated oligo(dT)为引物反转录合成cDNA；以一种限制性内切酶(锚定酶 Anchoring Enzyme，AE)酶切。锚定酶要求至少在每一种转录物上有一个酶切位点，一般4碱基限制性内切酶能达到这种要求，因为大多数mRNA要长于256碱基(44)。通过链霉抗生物素蛋白珠收集cDNA3端部分。对每一个mRNA只收集其polyA尾与最近的酶切位点之间的片段。,SAGE的实验路线,content,将cDNA等分为A和B两部分，分别
3、连接接头A或接头B。每一种接头都含有标签酶(Tagging Enzyme TE)酶切位点序列(标签酶是一种类限制酶，它能在距识别位点约20碱基的位置切割DNA双链)。接头的结构为引物A/B序列+标签酶识别位点+锚定酶识别位点。,content,用标签酶酶切产生连有接头的短cDNA片段(约910碱基)，混合并连接两个cDNA池的短cDNA片段，构成双标签后，以引物A和B扩增。用锚定酶切割扩增产物，抽提双标签(Ditga)片段并克隆、测序。一般每一个克隆最少有10个标签序列，克隆的标签数处于1050之间。对标签数据进行处理。,content,content,B.RNA的选择性剪接技术,通过不同的剪
4、接方式有一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程RNA的选择性剪接,平衡剪接5/选择性剪接3/选择性剪接外显子遗漏性剪接相互排斥性剪接,content,使用RT-PCR技术,对不同组织来源的RNA样品进行扩增,PCR产物是否存在大小差异,测序，差异产生的原因是否是选择性剪接,content,C.原位杂交技术,原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪60年代。1969年美国耶鲁大学的Gall等首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，将该基因进行定位，与此同时BuongiornoNardel
5、li和Amaldi等(1970)相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交技术。,content,原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。,content,为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定；具有能与特定片段互补的核苷 酸序列(即探针)；有与探针结合的标记物。,content,基因组原位杂交技术 基因组原位杂交(Genome in s
6、itu hybridization，GISH)技术是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交技术。它主要是利用物种之间DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作封阻，在靶染色体上进行原位杂交。GISH技术最初应用于动物方面的研究,content,荧光原位杂交技术 荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位杂交技术。它利用荧光标记的核酸片段为探针，与染色体上或DNA显微切片上的特异fl-N：-行杂交，通过荧光检测系统(荧光显微镜)检测信号DNA序列在染色
7、体或DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂交位点。FISH技术检测时间短，检测灵敏度高，无污染，已广泛应用于染色体的鉴定、基因定位和异常染色体检测等领域。,content,多彩色荧光原位杂交技术 多彩色荧光原位杂交(Multicolor fluorescence in situ hybridization，mFISH)是在荧光原位杂交技术的基础上发展起来的一种新技术。它用几种不同颜色的荧光素单独或混合标记的探针进行原位杂交，能同时检测多个靶位，各靶位在荧光显微镜下和照片上的颜色不同，呈现多种色彩，因而被称为多彩色荧光原位杂交。它克服了FISH技术的局限，能同时检测多个基因，在检测遗传物
8、质的突变和染色体上基因定位等方面得到了广泛的应用,content,content,content,content,D.基因定点突变技术,定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的 DNA 片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高 DNA 所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。,content,点突变，也称作 单碱基替换（single base substitution），指由单个碱基改变发生的突变。可以分为转换（transitions）和颠换（transvers
9、ions）两类。转换：嘌呤和嘌呤之间的替换，或嘧啶和嘧啶之间的替换。颠换：嘌呤和嘧啶之间的替换。,content,点突变可依发生位置对基因功能的影响而作以下分类：无义突变（nonsense mutation）：使原本可制造 蛋白质 的密码变成停止密码。错义突变（missense mutation）：使密码所对应的氨基酸改变。沉默突变（silent mutation）：密码改变，但对应的氨基酸不变。,content,content,content,content,二、基因敲除技术,content,经典遗传学的认知路线为由表及里，即通过杂交等手段观察表型性状的变化而推知遗传基因的存在与变化。,反向
10、遗传学是一条由里及表的认知路线，即通过DNA重组等技术有目的地、精确定位地改造改造基因的精细结构以确定这些变化对表型性状的直接影响。,content,利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤,基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体,content,ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向
11、，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。,content,同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用,content,选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率为10210-5，植物的概率为104105。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正
12、负筛选法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。,content,表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。,得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。,content,基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤,content,由嵌合体得到基因敲除的纯合体小鼠,content,条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。它实际上是在
13、常规的基因敲除的基础上，利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。,content,利用CreLoxP 和来自酵母的FLPfrt 系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型。通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP 的(“loxP floxed”)ES 细胞产生“loxP floxed”小鼠,然后，通过将“loxP floxed”小鼠与Cre 转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre 重组酶)，产生靶基因发生特定方式(如
14、特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。,content,在“loxP floxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，故“1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一样。但当它与Cre 转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“loxP floxed”靶基因和Cre 基因。Cre 基因表达产生的Cre 重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP 间发生切除反应，结果将一个loxP 和靶基因切除。这样，靶基因的修饰(切除)是以Cre 的表达为前提的。,content,Cre 的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性：即Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修
15、饰(切除)就发生在哪种组织细胞；而Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。所以只要控制Cre 的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度。,content,条件性基因敲除的基因重组及切除步骤,content,诱导性基因敲除也是以Cre/loxp 系统为基础，但却是利用控制Cre 表达的启动子的活性或所表达的Cre 酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre 基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP 动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因
16、敲除技术。,content,人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。,content,四环素诱导的基因敲除过程,content,基因捕获法是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法。通常基因捕获载体还包括一个无启动子的报道基因，通常是neo 基因，neo 基因插入到ES 细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的ES 克隆可以很容易地在含G418 的选择培养基中筛选出来。从理论上讲，在选择培养基中存活的
17、克隆应该100地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得。,content,需要敲除的靶基因转录翻译出活性蛋白,content,插入了靶目标的基因转录翻译出无活性的目标蛋白随机插入内含子中,content,需要敲除的靶基因转录翻译出活性蛋白,content,农杆菌Ti(tumor inducing)或Ri(root inducing)质粒中的一段DNA序列,可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中,已成为植物分子生物学中广泛应用的遗传转化载体。,农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，
18、并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。,content,content,三、蛋白质及RNA相互作用技术,content,酵母单杂交技术最早是1993年由Li等从酵母双杂交技术发展而来，通过对报告基因的表型检测，分析DNA与蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。由于酵
19、母单杂交方法检测特定转录因子与顺式作用元件专一性相互作用的敏感性和可靠性，现已被广泛用于克隆细胞中含量微弱的、用生化手段难以纯化的特定转录因子。,A.酵母单杂交系统,content,酵母单杂交(Yeast one-hybrid)是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。其理论基础是：许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区(DNA-binding domain BD)和转录激活区(Activation domain AD)组成，因此可构建各种基因与AD的融合表达载体，在酵母中表达为
20、融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出与靶元件有特异结合区域的蛋白。理论上，在单杂交检测中，任何靶元件都可被用于筛选一种与之有特异结合区域的蛋白。,content,将已知顺式作用元件构建到最基本启动子（Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin下游。将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活 Pmin启动子，使报告基因得到表达。,content,从拟南芥cDNA文库中 筛选与顺式元 件DRE结合的 转录因子示意图。,content,B.酵母双杂交系统,酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质的基因分别
21、克隆到酵母表达质粒的转录激活因子(如GAL4等)的DNA结合结构域基因和GAL4激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。,content,转录激活因子在结构上是组件式的(modular),即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结合结构域(DNA binding domain,简称为DB)和转录激活结构域(activation domain,简称为AD),它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合,但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。,content,酵母双
22、杂交的基本原理示意图,content,content,C.体外蛋白质相互作用技术,Far Western印迹技术用32P标记的体外表达蛋白作探针,直接检测 与该蛋白发生相互作用的蛋白或表达该蛋白 的cDNA。,content,content,GST融合蛋白沉降技术利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲 和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作 用蛋白。,content,content,蛋白质芯片技术蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的 相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质 芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可 以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相 互作用蛋白点。,content,con
23、tent,免疫共沉淀技术将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可 能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入 反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法 在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合 物沉淀到试管的底部或微膜上。,content,content,D.细胞内蛋白质相互作用研究荧光共振能量转移法（FRET）,FRET荧光能量转移有三个基本条件：给体与受体在合适的距离（110 nm）；给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠（这是能量匹配的条件）；给体与受体的偶极具有一定的空间取 向（这是偶极-偶极耦合作用的条件）。,content,content,E.RNAi（RNA干涉）技术及其应用,利用双链
24、小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。,content,这些小的双链RNA称为siRNA（Small/short interfering RNA，siRNA）。研究发现，双链RNA是RNAi的触发物，引 发与之互补的单链RNA（ssRNA,single-stranded RNA）的降解。,content,发现RNA干扰现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物中细胞。又先后发现小鼠早期胚胎中和大肠杆菌中也存在干扰现象,siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义s
25、iRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。,content,content,content,content,四、基因芯片及数据分析,content,基因芯片及数据分析基因芯片（DNA chip），又称DNA微阵列（DNA microarray）技术是能同时监测大量靶 基因表达的实验手段，从而迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录 本的变化规律。,该技术系指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于 400）探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探
26、针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。,content,在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。,content,基因芯片研制的总体蓝图,研制方向的确定,基因组序列分析与待检基因探针序列的确定,检测样品 的制备,探针阵列的准备,检测设备的研制,杂交检测与数据分析,content,基因芯片技术的主要特点：技术操作简单 自动化程高 序列数量大 检测效率高 应用范围广 成本相对低,cont
27、ent,content,五、利用酵母鉴定靶基因功能,content,六、其他分子生物学技术,content,凝胶阻滞实验（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）,又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay），是用于体外研究DNA与蛋白质 相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。,content,原理：在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩
28、短了。所以，当某个DNA片段与细胞提取物混合之后，若它在凝胶电泳中的移动距离变小了，就说明它可能已与提取物中的某种特殊蛋白质分子相结合了。,content,content,EMSA还被用于研究与蛋白质相结合的DNA序列的特异型。,content,噬菌体展示（phage display）技术,噬菌体是细菌病毒的总称，英文为 Bacteriophage，来源于希腊文“phagos”，有“吞噬”之意。噬菌体可被分为溶菌周期和溶源周期两种不同的类型。在溶菌周期，噬菌体将其感染的宿主细胞转变成为噬菌体的“制造厂”，产生出大量的子代噬菌体颗粒。实验室常将只具有溶菌生长周期的噬菌体叫作烈性噬菌体。溶源生长周
29、期是指噬菌体DNA被整合到宿主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分，感染过程中不产生子代噬菌体颗粒。具有这种溶源周期的噬菌体被称为温和噬菌体。,content,这种技术的基本原理，是将编码外源蛋白或多肽的基因片段插入编码噬菌体外壳蛋白的基因中，使外源蛋白或多肽与噬菌体外壳蛋白融合表达在噬菌体表面，被展示的多肽、蛋白可保持相对独立的空间结构和生物活性而不影响噬菌体的侵染和扩增能力。其主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内。,content,分别将编码不同蛋白质或多肽的DNA片段插入在基因III的编码序列中，使在噬菌体颗粒的表面展现出各种不同的蛋白质或多肽，此即通常所说的随机多肽文库。,content,content,蛋白质磷酸化分析技术,由于细胞内可能有多达上千个蛋白激酶，体内检测某个蛋白激酶活性非常困难，科学家常用体外激酶活性分析法来检测蛋白激酶活性。该方法能十分可靠地鉴定某个蛋白激酶对底物的磷酸化作用，筛查激酶的特异性底物。,content,content,1、简述原位杂交技术的原理及实验流程2、简述酵母双杂交技术的原理及实验流程3、简述RNAi技术的原理及实验流程4、列举至少三种研究DNA与蛋白质相互作用 和蛋白质与蛋白质相互作用的方法,谢谢！,
