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1、实验一、动物基因组DNA的分离,实验目的：通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤。,分离纯化核酸总的原则：应保证核酸一级结构的完整性 排除其它分子的污染。核酸纯化应达到的要求：核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；排除其它核酸分子的污染；其它生物大分子的污染应降低到最低程度。,实 验 目 的,通过实验学习从动物组织中制备染色体DNA的方法。学习琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度、DNA的构型、含量以及分子量的大小。掌握DNA样品的纯化和定量检测方法。,组织裂解液裂解细胞:SDS能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸。EDTA可抑制DNA酶的活性。NaC
2、l;TrisHCl;EDTA；SDS；蛋白酶K；无DNA酶的RNA酶,实 验 原 理,用蛋白酶K水解蛋白质蛋白酶K具有广泛的切割活性，可消化细胞，降解蛋白质。有机溶剂酚、氯仿抽提苯酚使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。氯仿加速有机相与液相分层，最后用氯仿抽提可去除核酸溶液中的迹量酚。异戊醇减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡；有助于分相。,在高盐条件下，用乙醇沉淀DNADNA不溶于乙醇，乙醇可以沉淀DNA。NaAc：Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀;调节PH值接近DNA等电点；再用70%乙醇洗除沉淀中的盐分即可获得染色体DNA,酚：氯仿
3、：异戊醇（25：4：1）70%乙醇TE bufferRNAse琼脂糖TAE电泳缓冲液电泳设备紫外分光光度计凝胶成像系统,实 验 材 料,溶液与缓冲液匀浆缓冲液STE：100 mmol/L NaCl10 mmol/L TrisHCl，pH 8.025 mmol/L EDTA，pH 8.0。消化缓冲液：100 mmol/L NaCl10 mmol/L TrisHCl，pH 8.025 mmol/L EDTA，pH 8.0,0.5%SDS（临用前加）。0.1 mg/mL 蛋白酶K（临用前加）。无DNA酶的RNA酶(10 mg/L)：将胰RNA酶溶于10 mmol/L TrisHCl，pH 7.5，1
4、5 mmol/L NaCl溶液中，使浓度为10 mg/L，于100 水浴处理15 min，以降解DNA酶，缓慢冷却到室温，20保存。TE缓冲液：10 mmol/L TrisHCl，pH 8.01 mmol/L EDTA，pH 8.0平衡酚:氯仿:异戊醇25:24:1（体积比）。3 mol/L NaAc，pH 5.2：称取408 g NaAc3H2O溶于水，用3 mol/L乙酸调节至pH 5.2。无水乙醇。70冷乙醇,实验步骤：DNA提取,1.材料准备2.破碎细胞或包膜内容物释放3.核酸分离、纯化4.沉淀或吸附核酸，并去除杂质5.核酸溶解在适量缓冲液或水中,1、先将动物组织进行预处理：大的器官应
5、该切成易处理的小块（1 cm3）以便冻存（用液氮）及处理。任何组织都可采用，但是，如需肝脏，在杀动物之前应该禁食24 h，可提高DNA的质量。收集的组织可以在70下保存几年。2、取0.2 g组织块剪碎后，加入2.0 mL匀浆缓冲液，用组织匀浆器匀浆至无明显组织块存在（冰浴操作）。3、将组织细胞的匀浆液体转移至2.0 mL离心管中，4、加入蛋白酶k，轻轻反转混匀，37温育1218 h。温育结束前1h加RNAe至终浓度200 g/mL,5、加入等体积酚氯仿异戊醇（25：4：1）等体积抽提13次，缓慢颠倒离心管使两相均匀混合形成乳浊液，静置3min。12000 rpm，离心5分钟,扩口吸头小心吸出离
6、心管中的上层液体，即为含DNA的水相，注意不要吸中间界面上一层厚的白色物质（蛋白质沉淀）。6加入1/10倍体积3M NaAc（pH5.2），2倍体积无水乙醇充分混匀，-20下15-20min。7415000 rpm，离心min。8DNA沉淀用冰预冷70%乙醇洗1次，开盖37 干燥10min（使乙醇挥发）。9根据沉淀量加入 TE buffer，37 水浴至沉淀溶解，20冰箱保存。,如果要对提取的DNA进行完整性鉴定，可通过琼脂糖凝胶。方法是取1 l溶解的DNA样品，在0.8的琼脂糖凝胶中进行电泳，用dured染色观察结果。10取1l DNA 0.8%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统记录和分析结果，估
7、计样品DNA分子量。11取10 l DNA母液稀释至1000ul，在紫外分光光度计上测A260和A280。计算样品DNA浓度，判断样品浓度和DNA纯度。,DNA制备注意事项,1.要颠倒摇动试管悬浮沉淀，不可用枪头(尤其是没剪去枪头尖端）吹打沉淀。2.吸上清枪头使用前必须粗吸头（微量移液枪的枪头剪去尖端，并用火烧一下，使之圆钝），避免机械剪切力对DNA链的损伤。3.为了获得高分子量的DNA，操作中必须防止混匀、抽提及 沉淀时剧烈机械震荡造成的DNA的断裂。4.如含有RNA,可用100ng/ml的RNase在37水解至少半小时。,实验二.DNA浓度与纯度的测定,DNA浓度的分光光度计测定原理：核酸
8、的紫外吸收碱基含有共轭双键，使相关化合物在240-290 nm的紫外波段有强烈的吸收峰，最大吸收值在260nm左右组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值的波长为250270 nm之间。,实 验 原 理,OD260的应用：,DNA或RNA的定量:OD260=1.0相当于50g/ml双链DNA40g/ml单链RNA20g/ml单链寡聚核苷酸,2.判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0含杂蛋白及苯酚，OD260/OD280降低如果制备的DNA样品A260/A2802，说明样品中RNA过高，可用RNase消化后，用酚、
9、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA；如果样品A260/A280为1.82.0，说明样品中盐的含量过高，样品沉淀后应用70%乙醇多洗一遍。也会出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况，所以有必要结合凝胶电泳等方法检测有无RNA，或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。纯净的RNA A260/A280=2.0,提取的RNA样品A260/A280应大于1.80。RNA样品含有蛋白质会使A260/A280比值下降。,实验步骤：,以TE缓冲液为空白对照；将基因组DNA溶液分别用TE缓冲液稀释50倍、80倍、100倍至4ml，分别测OD260和OD280；基因组DNA浓度为：OD260 核
10、酸稀释倍数50（g/mL）；样品各稀释级别算得的浓度平均值，即作为该样品的实际DNA浓度。以OD260/OD280初步判断提取基因组DNA的纯度。,1.为防止读数漂移：选用TE缓冲液为溶剂（PH一定，离子强度低）合适的稀释浓度，保证吸光值在范围内混合要均匀，无气泡和悬浮物，视窗干净2.测定光吸收值时，用稀释DNA样品的溶液做对照。3.选择稀释要适当，应在检测范围之内。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25 g/mL的核酸溶液。,DNA定量注意事项,（二）DNA质量与浓度的琼脂凝胶电泳法测定,DNA带负电荷，阴极阳极 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。前者由分子所带净电荷
11、量的多少而定，后者则主要与分子大小及其构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，在用电泳法测定DNA分子大小时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定，提高分辨率。同时适当减低电泳时的电压，也可使分子筛效应相对增加而提高分辨率。,DNA在琼脂糖凝胶中的迁移率取决于：1.DNA分子的大小 DNA迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比.2.琼脂糖浓度越大，DNA迁移率越低 3.DNA的构象 超螺旋环状线状 开环状 4.凝胶中、电泳缓冲液中的溴化乙锭 降低DNA的迁移率,5.电压：低电压时，
12、迁移率与电压成正比 适宜电压：5-8V/cm6.电泳缓冲液：离子强度适中 主要：TAE,TBE，TPE,操作步骤,琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB(一)根据被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：琼脂糖凝胶浓度 线性DNA的有效分离范围kb 0.3 560 0.6 120 O.7 0.810 O.9 0.57 1.2 0.46 1.5 0.24 2.0 0.13 实验用1.2琼脂糖。称取1.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100mL 1xTAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀即可。,样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝加样：加样端为负极（黑）电泳：5V/cm观察
13、：紫外灯下观察，照相,溶 胶,凝胶冷却至50C，加EB至终浓度0.5g/ml,(二)凝胶板的制备：取干净的有机玻璃内槽，将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严，不能留缝隙)。,加梳子，倒胶：将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子，将冷到60左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。,凝胶凝固后取出梳子,待胶凝固后，小心地拔出梳子，撕下透明胶带，然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。注意：DNA样品孔应朝向负电极一端。加缓冲液加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米。,凝胶上样缓冲液（6）蔗 糖 40 溴酚蓝 0.25
14、,点 样,电 泳,注意观察溴酚蓝染液的迁移,紫外灯下观察电泳结果,照 相,电泳注意事项,1.琼脂糖的质量：琼脂糖（agarose）是以质量较好的琼脂作原料制成的。琼脂是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物。琼脂胶是一种含有硫酸根和羟基的多糖。它具有离子交换性质，这种性质将给电泳带来电渗作用的不良影响，因而必须去除干净。所谓琼脂糖的质量不过关就是琼脂糖内含有较高比例的琼脂胶。琼脂糖是一种直链多糖，它由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成的线性多聚糖。由于链状琼脂糖分子相互以氢键交联，因此与琼脂一样能形成凝胶。琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基因，不引起DNA变性，又不吸附被分离的物质，
15、因此它是一种很好的凝胶剂。,2.DNA分子的迁移率：影响DNA分子在电泳中的迁移率的因素是多方面的，除了决定于DNA分子大小与构型外，还有琼脂糖的浓度、电压大小、缓冲液pH值和电泳时的温度等。为了精确测定其分子量的大小，采用一下措施：(1)每次测定时，要有已知分子量的DNA片段作为标准，进行对照。电泳。(2)选择最合适的电泳条件。(3)提高分子筛效应，降低电荷效应。,3.EB染色：EB是核酸的显色剂，使用EB对DNA染色的3种方法：(1)在制胶中与电泳缓冲液中同时加入EB。(2)只在胶中加入EB，在电泳缓冲液中不加。这样可减少操作时双手受EB污染的可能。(3)在电泳结束后，取出凝胶，放在含有E
16、B的电泳缓冲液或DDW中浸染10-30分钟。EB为强诱变剂，剧毒，操作时要带一次性手套，并在专区间操作。用过的手套要及时将手套顺手翻过来，让有EB的面朝里，有EB的废液和器皿不能随便丢弃，要用专门方法处理后丢弃。,DNA和RNA本身并不产生荧光，但在荧光染料溴化乙锭（ethidiun bromide,EB）嵌入碱基平面之间后，DNA样品在紫外线照射激发下，可以发出红色荧光，其荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA溶液做标准对照，可以比较出被测DNA溶液的浓度。灵敏度可达110 ng。EB见光易分解，故应存棕色试剂瓶中于4条件下保存。染色时也应避光。电泳后应立即染色观察或拍照记
17、录。若不能马上拍照，可用保鲜膜或塑料袋封好置于4下过夜，核酸带型改变不大。,染色一般是在凝胶或电泳缓冲液中加入终浓度为0.5 g/mL的EB，但是由于EB带正电荷，中和核酸分子的负电荷，同时它的嵌入增加了核酸分子的刚性，使迁移率减慢，故不宜用于凝胶电泳测定核酸分子的大小。利用凝胶电泳比较估计或测定样品DNA的含量，也不适合在凝胶中直接加入EB，因此在凝胶中，游离的EB分子向负极游动，会使样品中前后各带染色不均匀，影响定量。故应在电泳后，将凝胶浸入0.5 g/mL的EB水溶液中10 min进行染色。,4溴酚蓝指示剂缓冲溶液的作用：含有50%蔗糖，可增加上样DNA溶液的密度，以确保DNA样品沉入点
18、样孔内，起DNA电泳时的前沿指示剂作用。一般溴酚蓝的电泳迁移位置相当于300400bp双链线状DNA。5点样量太高易产生拖尾与弥散现象，样品迁移速度减慢。点样量太少，分辨不清，影响结果。如果DNA已经降解，DNA的带就会拖尾巴，或出现弥散性分布，而不能形成清晰、紧凑的带纹，这样的DNA样品不能用于进一步研究。,比较样品DNA条带与DNA标准条带的亮度即可对样品DNA进行定量。肉眼（10 ng），但通过图像处理设备和凝胶分析软件，分析，通过DNA标准绘制出DNA量与条带亮度的标准曲线，估算出未知样品中的DNA含量。另外在比较时，应该考虑DNA或RNA样品中分子大小与标准对照中核酸分子的长度。不同
19、大小的DNA片段在凝胶中的迁移速度不同，据此，科研工作者们便能判断DNA的分子质量，其有无降解。同时，通过同已知分子质量的标准DNA片段之间的比较，还可以测定出随迁移的DNA片段的分子质量。,荧光分析法灵敏快速，不但能测定浓度小于0.25 g/mL的样品，还可了解核酸样品中由于RNA或非核酸类杂质的污染而干扰紫外吸收的情形。但它的荧光强度决定于溴化乙锭嵌入碱基中的多少，这与DNA的超螺旋程度密切相关，标准品与样品难以完全一致，并且还受其它影响荧光发光污染物的影响。,准备一个对照，只放TE缓冲液。1、分光光度计提前15 min 打开。2、将TE缓冲液转入紫外分光光度计的石英比色皿中，校正零点。D
20、NA的样品的浓度为OD260值核酸稀释倍数50（g/mL）；RNA的样品的浓度为：OD260值核酸稀释倍数40（g/mL）。注意：每次测定完必须用TE缓冲液冲洗比色皿后，才能加入第二个样品，以保证测定的准确性。3、根据DNA母液的浓度，即可计算出所用DNA量的体积。通过电泳检查DNA质量，没降解的DNA一般出现一条相对集中的带，电泳方法见实验。,思 考 题,实验中影响染色体DNA完整的因素有哪些？如何减少这些因素对完整性的影响？如何判断提取的染色体DNA样品的质量？为了获得清晰的DNA样品电泳图，在琼脂糖凝胶电泳过程中应该注意哪些问题？如何选择测量DNA的合适的稀释倍数？为什么需要对DNA进行纯化？,
