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1、反义RNA的原理及其应用实例,制作人：余萍,反义RNA,反义RNAA(a n t i s e n s e R N A）：一种本身缺乏编 码能力，但能与特异靶 R N A(主要是mR N A)互补的 R NA分子，它可通过配对碱基间氢键作用与靶 R N A的特定互补区域结合形成双链复合物，抑制靶 RNA的功能，从而调控基因的正常表达。,基本原理,反义 R N A技术的基本原理：利用自然存在的或人工合 成的反义 RNA，通过基因重组技术反向插入到合适 的表达载体形成重组DN A，然后转染受体细胞，则 这一反插入的序列就会随细胞周期产生大量反义 R NA，对基因的表达进行调控，从而抑制、封闭或破坏靶
2、基因的表达。,一、复制水平,DNA复制 中的作用 反义 R N A作为D N A复制的抑制因子，与引物 R N A结合或作用于引物前体而抑制 D N A复制，从 而降低D N A的复制效率。E c o l i 的 c o l e 1 质粒复 制的前提是合成适当的R N A(R N A)，它自动折叠 后与 D N A模板结合形成 D N A复制的引物，从复制起始点上游一4 4 5 b p 处开始，以另一 D N A为模板反 向转录的RN A I正好与 RNA1 I的结合，阻止了正 常引物的产生，从而干扰复制的进行。,作用机制,反义 R N A的作用机制主要表现在D N A复制、转录 和翻译 3个
3、水平上。,二、转录水平,转录及转录后水平的作用 反义 R NA与 m RNA 5 末端互补结合，阻断帽 子结构形成；作用于外显子和内含子的连接区，阻碍前 m R N A剪接；作用于 p o l y A形成位点，阻碍 mRN A的成熟及其向胞浆转运。在 c r p 基因的t i c R NA(t r a n s c r i p t i o n i n h i b i t o r y c omp l e me n t a r y RNA)负 向 自我调控中，t i c R N A与 e r p m R N A的 5 端结合，形 成类似于R N A聚合酶识别的转录终止信号的二级 结构，以反式作用对转
4、录过程本身进行调控 J,三、翻译水平,翻译水平的作用 反义 R NA可直接与 m R N A的 S D序列(含 R B S)或编码区(主要是 A U G)结合，从空间上直接 阻止核糖体的正常结合或可直接降解靶 mR N A。反义R N A与 m R N A在 S D序列配对形成吻触复合体或在互补区段结合形成 R N AR N A双链结构，从而调控翻译的进行。在真核生物细胞中有许多 R N A在翻译水平上表现反义R N A的功能。如鸡胚 胎肌浆中存在的富含 U的小分子 R N A称为 t c RNA，它们可以与肌球蛋白重链的 RN A的 p o l y A尾杂交而抑制正常的翻译过程。A u d
5、r e y等 J 的研究表明 F GFAS R NA在翻译过程能有效地抑制F GF一2在哺乳动物细胞中的表达。,反义 RNA的重组 DNA中只有启动子及终止子，当转染细胞后，重组 D N A能 自动表达反义R N A，并且重组 D NA自身可以整合到宿主的基因组 D NA中，或作为“附加体”长期存在。在原核细胞中，反义 R N A以针对 S D序列效果最好，而在真核细胞中以5 端非编码区为标靶最有效。,反义RNA的应用,随着基因组草图的完成,人们研究的重点已转向对基因功能的研究,反义核酸技术无疑为这项宏伟的工程提供了一种有力的工具。,抗病毒作用,病毒是 对人 和动植 物危 害极大 的病原体,然
6、而对病毒引起 的疾病的治疗,目前 尚无特效药物与方法。反义 R N A 却能特异性阻断病毒基因表达 和抑制病毒的复制,从而激起许多科学工作者去探索反义 R N A 治疗病毒性疾病的有效方法。抗病毒反义 R N A 技术是将特定的病毒基因反 向插人到表达险载体中,以构建反义 R N A 表达载体,再将重组体导人真核细胞(病毒宿主细胞)中表达特异性反义 R N A,从而抑制特异有 害基 因的表达或抑制病毒复制。文献报道,运用反义 R N A技术 己经成功地抑制疤病毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒(H I V)等对培养的组织细胞的侵袭。用针对植物病 毒的反义 R N A 已培育出具有抗病毒能力 的植
7、物。,姚志强等针对不同靶位设计了1 0 段互补反义核酸(D NA片段)，经模型筛选发现针对S基因起始区、S P 2增强子帽区和 p o l y A信号编码区的a s O Ns 作用最强，揭示反调节基因转录/翻译起始区的反义核酸具有明显的抗病毒作用。G a b o r 等(1 9 9 8)使用内源性表达抗HI V一1po1 vif和 enr 基因，以及 3 L T R序列的反义 R N A方案，构建了 Mu L V L T R启动子逆转录病毒重组质粒，转录 C D 4 淋巴细胞系，结果表明反义 R N A能高效地稳定表达，反义 e n v R N A能够最有效地抑制HI V一1 的复制，并且反义
8、 p o l R NA使P 2 4 抗原减少 了 1 0 01 0 0 0倍。另外，国内外在应用反义R N A技术培育抗病(如猪瘟、抗鸡马立克氏病等)动物品系方面也取得比较明显的进展。,反义 R N A 的抗肿瘤作用,肿瘤 的发生是多因素引起的,其中细胞癌基因或/和某些病毒癌基因的异常激活和过度表达是导致细胞恶变的原因之一。如何控制细胞有害基 因的表达而在基因水平上治疗恶性肿瘤呢?在目前基 因治疗的众多方案中,反义R N A 技术是 最具吸引力的手段之一。可以设计出针对肿瘤细胞 的癌基因、突变基因、非正常表达基因及某些肿瘤相关病毒的癌基因反义 R N A,以阻断这些有害基因的表达,达到治疗肿瘤
9、的目的。许多证据表明,反义R N A 可使肿瘤 细胞的表型逆转,形态变化,增殖速度减慢,生存期缩短,软琼脂中克隆能力下降及体内成瘤能力减弱等,而不影响细 胞生存所必需的其它基因的表达。,Tr o j a n 等利用 E B 病毒游离体表达载体克隆胰岛素样生 长因子(I G F)反 义基因,将此重组体转染 大鼠 C 6 细胞系,在大鼠模型上实现了胶质母 细胞瘤的基因治疗和预防。我国学者赵晓航等报道互补于 G r n yc基 因第二外显子及其两侧序列的反义 R N A 能特异性诱发人食管癌细胞程序性死 亡。黄 贤 明等利用 G e t s一2、G m y c和 N一r as三个癌基 因联合反义 R
10、 N A 能使人肝 癌细 胞 株 S M M C 77 2 1 生长速率下降约70%,软琼脂集落形成能力及裸鼠致瘤能力显著下降,提示针对多个癌基 因的联合反义R N A 可能给肿瘤基因治疗提供新的途径。,反义 RNA技术还可用于肠道疾病(R o t b a r t e t a 1，1 9 8 8)、心血管疾病、B 一地中海贫血、调节衰弱心脏中肌细胞的 C a2 泵体内平衡u、G蛋白防止高血压、肝纤维化等多种疾病的研究。,参考文献 1 张西锋，沈伟,潘庆杰,白丁平，耿社 民反义 R NA技术原理及其在疾病治疗中的应用 J.莱阳农学院学报,2 0 0 4,2 1(1)：2 0,21,2 2 2.孟博 综述，朱大海审校.反义RNA 技术的应用与进展 J 国外医学遗传学分册,2001,2 4(6)：292 3 汤郡,张莉,郭辉玉反义RNA技术及其应用 J 广州医学院学报，1 9 9 9，2 7(2)：8 4,8 5,谢谢！,
