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1、课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,3、课题的目的-土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,1、实例：,DNA多聚酶链式反应(PCR技术)是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。,.筛选菌株,提出的问题 如何寻找耐高温的酶？解决问
2、题的思路寻找耐高温环境；,启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,原理高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌，耐高温菌种提取耐高温酶。,2、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,什么是选择性培养基？,筛选的方法,利用选择培养基进行分离,请设计：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：,从物理性质看此培养基属于哪类？,固体培养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,问：培养基选择分解尿素的微生物的原理是什么？,培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解
3、尿素,问 怎样证明此培养基具有选择性呢？,以尿素为唯一氮源的培养基,牛肉膏蛋白胨培养基,是,分离尿素细菌,作对照判断实验组培养基有无选择性,只生长分解尿素的细菌,生长多种微生物,是,1、显微镜直接计数：,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,.统计菌落数目：,不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点,2.间接计数法（活菌计数法）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数(CV)M其中，C
4、代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,.设置对照：,实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌 落数目的实验时，A同学从对应的106 倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌 落，但是其他同学在同样的稀释度下 只选择出大约50个菌落。分析其原因。,原因：土样不同，
5、培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质),小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,实验设计,实验设计的内容：包括对实验方案、仪器、材料、用具和药品，具体的实验步骤及时间安排等的综合考虑和安排。实验设计的要求：周密细致。,实验流程,土壤取样 制备培养基 样品稀释取样涂布 微生物的培养与观察 细菌的计数,实
6、验操作,（1）土壤取样：从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样。将样品装入事先准备好的信封中。,注意事项：无菌操作：铁铲和信封都要灭菌。后面称取土壤、将称好的土样倒入锥形瓶、稀释土壤溶液，每一步都要在火焰旁操作。,实验操作,（2）制备培养基：制备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。牛肉膏蛋白胨培养基可作为对照，判断选择培养基是否起到了选择作用。将菌液稀释103107倍。每个稀释度下需要3个选择培养基，一个牛肉膏蛋白胨培养基。因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。准备8支灭菌的试管和1支灭菌的移液管。,实验操作,（3）样品稀释：将10g土样加入盛有90ml无菌生理盐水
7、的锥形瓶中，充分摇匀，吸取上清液1ml，转移至盛有9ml生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度。,实验操作,（4）微生物的培养与观察 按照由107103稀释度的顺序分别吸取0.1 ml菌液涂布平板，按照浓度从低到高的顺序涂布平板，然后将平板置于30培养箱内培养2d。每隔24h比较一次牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基菌落的数量、形态等，并做好记录。挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红指示剂的培养基的斜面上，观察能否产生颜色反应。,注意事项：做好标记：本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好在使用前就做好标记。例如，在标记培养皿时，应注明培养基种类、培养日期以及平板上培养样品的
8、稀释度等。在进行系列稀释的时候，为避免试管相互混淆，可以将已经进行过稀释操作的试管，按稀释度递增的顺序，依次放置在试管架的另一行。这样，试管的位置就能清楚地表示出稀释进行到哪一步。,实验操作,（5）细菌的计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数在30300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。,结果分析与评价,1、培养物中是否有杂菌污染,对照的培养皿中无菌落生长，说明培养基未被杂菌污染。反之，则被杂菌污染。,结果分析与评价,2、选择培养基是否筛选出菌落,牛肉膏培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目，说明选择培养基
9、已筛选出一些菌落。,结果分析与评价,3、样品的稀释操作是否成功,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。,结果分析与评价,4、重复组的结果是否一致,如果不同同学选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要分析产生差异的原因。,二.实验的具体操作.土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。,应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,三样品
10、的稀释,.取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,.取样涂布,分离不同的微生物采用不同的稀释度,原因：不同微生物在土壤中含量不同,.微生物的培养与观察,思考：要将哪些培养皿进行培养？,.微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：3037培养12d放线菌：2528培养57d霉菌：2528的温度下培养34d。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释
11、倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,微生物的培养与观察,三.结果分析与评价1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。2.提示：选择每个平板上长有30300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。,四、操作提示,无菌操作,做好标记,规划时间,五.课外延伸 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用
12、细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。,大肠杆菌呈 黑色中心,有或无金属光泽,大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,本课题知识小结:,六、例题解析,在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是A调整期 B对数期 C稳定期 D衰亡期,C,1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（）
13、A.在液体培养基上进行 B.至少接种一种细菌 C.接种一个细菌 D.及时补充消耗的营养物质 2.使用选择培养基的目的是（）A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,实践训练,A,C,D,4.下列说法不正确的是（）A.科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组
14、中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐,B,C,例3（2005年江苏）抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是，青霉素是青霉菌的 代谢产物。在生产和科研中，常选用处于 期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，和 比较稳定。对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，再计算发酵罐中菌体的总数量。,异养需氧型,次级,对数,个体的形态,生理特性,称菌体的湿重（称烘干后的重量）,下课了,
